病毒性心肌炎患者外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ細胞因子水平的分析

陳　銳，陳艷清，賈　建，許　瑤，張達秀，李婉葵，邵錦歡

(東莞市塘廈醫院檢驗科，廣東東莞 523721)

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·臨床研究·

病毒性心肌炎患者外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ細胞因子水平的分析

陳銳，陳艷清，賈建，許瑤，張達秀，李婉葵，邵錦歡

(東莞市塘廈醫院檢驗科，廣東東莞 523721)

摘要:目的研究病毒性心肌炎患者外周血中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)的水平，分析上述指標與心肌炎的相關性。方法選取2013年1月至2015年1月間入院就診的病毒性心肌炎患者32例，作為實驗組。選取同期入院體檢的健康人32例作為對照組。應用ELISA方法檢測血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平。32例病毒性心肌炎患者應用常規抗病毒、鎮靜治療后，應用實時熒光定量PCR法檢測TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平，觀察并比較治療前后3項指標的變化。結果病毒性心肌炎患者急性期TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平水平最高，在恢復期稍有下降，當仍顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，病毒性心肌炎患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平明顯較高(P<0.05)。結論血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ水平變化在病毒性心肌炎發病中有重要作用，可在臨床作為病情判斷及療效評價的參考指標。

關鍵詞:病毒性心肌炎；腫瘤壞死因子-α；轉化生長因子-β1；細胞因子干擾素-γ

病毒性心肌炎(viral myocardtis，VMC)指病毒感染心肌細胞，導致細胞溶解引起心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎癥病變，結果造成病毒對心肌細胞直接損傷和繼發免疫反應對心肌組織的持續損害[1]。目前臨床尚未能確認VMC確切的發病機制，但機體免疫功能紊亂和炎性細胞因子在其發病中的作用不容小覷。細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，通過結合相應受體從而具有調節細胞生長、分化、調節免疫應答的作用。本研究就VMC患者外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ 細胞因子的水平進行了分析，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年1月至2015年1月間入院就診的病毒性心肌炎患者32例，作為實驗組。所有患者均符合成年人急性病毒性心肌炎的診斷參考標準[2-3]。選取同期入院體檢的健康人32例作為對照組。排除標準：先天性心臟病、心肌病等心臟疾病；1個月內無感染、腹瀉病史；智力及精神異常，無法配合此次研究者。實驗組32例患者中，男19例、女13例；年齡30～65歲，平均(46.25±12.03)歲；發病前1～3周均有上呼吸道感染史。對照組32例中男18例、女14例；年齡32～61歲，平均(46.32±11.91)歲。兩組在年齡、性別等基礎資料方面無統計學差異，可參與比較。

1.2方法

1.2.1標本采集所有受試者在清晨空腹抽取靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，分裝-20 ℃留存備用。

1.2.2標本的檢測應用ELISA檢測兩組患者血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白含量，試劑盒購自bd biosciences pharmingen公司。操作步驟如下，(1)標準曲線：凍干標準品復溶，靜置15 min，倍比梯度稀釋(標準曲線取7個點，最高濃度為1 000 pg/mL,標準品稀釋液直接加入作為0濃度)。(2)取標本血清及標準品100 μL加入相應孔中，封板，室溫孵育2 h，洗板5次，拍干。加生物素化抗體100 μL到每孔，封板，室溫孵育1 h，洗5次，拍干。加酶結合物100 μL，封板，暗室室溫孵育20 min，洗5次，拍干。加顯色劑100 μL，暗室室溫孵育20 min，加終止液100 μL終止反應。(3)酶標儀檢測，讀其A450值，繪制標準曲線，算出標本濃度。并在32例病毒性心肌炎患者應用常規抗病毒、鎮靜治療后，另行蛋白水平檢測。設定實驗組治療前為VMC急性期，治療后為VMC恢復期。

同時應用實時熒光定量PCR法，見表1，檢測兩組患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平。檢測試劑盒、引物和探針序列均由上海基康生物技術有限公司提供，檢測儀器使用羅氏 Lighteyeler 熒光定量PCR 儀。

2結果

2.1TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平病毒性心肌炎患者急性期TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平水平最高，在恢復期稍有下降，但仍顯著高于正常對照組(P<0.05)。見表2。

2.2TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平與對照組相比，病毒性心肌炎患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平明顯較高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表1　　實時熒光定量法檢測TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平

表2　　兩組患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平

#:與對照組相比，P<0.05；*:與VMC急性期相比，P<0.05。

表3　　兩組患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ

3討論

目前對VMC發病機制抑制存在諸多爭議，以免疫學說與細胞因子論支持者較多[4]。VMC是由多種病毒引起的以心肌間質炎癥為主的疾病，柯薩奇B組病毒是主要病原。病毒通過消化道或呼吸道侵入人體發生病毒血癥，侵犯心肌。感染初期機體首先發動細胞免疫反應，增強機體對病毒免疫力，同時單核巨噬細胞趨化，產生及分泌細胞因子[5]，進而調控疾病進展。

TNF-α是一種具有多種生物學活性的細胞因子，可增強中性粒細胞吞噬能力、促進細胞增殖與分化并具有抗感染作用，其既參與機體免疫系統，也是機體炎性反應及損傷的重要調節因子[6]。TNF-α來源廣泛，主要由巨噬細胞和活化的單核細胞產生，心臟既是TNF-α的合成場所又是其作用的靶器官。在本次研究中，TNF-α在VMC急性期表達高達(128.31±12.48)ng/L，且TNF-α mRNA水平也顯著高于對照組，提示TNF-α參與了病毒性心肌炎的發展過程。

TGF-β1是膠原纖維細胞外基質合成和沉積的強有力的始動因子，也是諸多因素導致心肌纖維化最后的共同的中介物之一，研究認為TGF-β1陽性表達是反映心肌炎癥性損傷修復的靈敏指標[7]。本次研究中，VMC急性期患者TGF-β1蛋白水平為(15.18±1.42)ng/mL，VMC恢復期則為(9.53±1.41)ng/mL，正常對照組僅為(6.27±0.83)ng/mL。汪東華等研究中[8]，TGF-β1在明確心肌炎患者中的表達水平高達(32.97±4.88)ng/mL，界限性心肌炎組則為(15.17±1.62)ng/mL，正常對照組TGF-β1水平僅為(6.62±0.98)ng/mL。提示TGF-β1在健康人中水平較低，而病毒性心肌炎病情越重則TGF-β1水平越高。同時本次研究中TGF-β1水平整體偏低可能與VMC患者病情程度有關。

IFN-γ是由活化的T細胞產生的，具有抗病毒的作用，同時通過參與誘導主要組織相容性復合體II類抗原的表達而發揮一定的免疫調節作用[9]。IFN-γ表達過高會引起自身細胞的損傷，并可通過影響細胞表面特定受體而產生負性肌力作用[10]。同時IFN-γ可抑制病毒復制，過低水平的IFN-γ不利于清除病毒。在本次研究中，VMC恢復期IFN-γ水平介于較高的VMC急性期及較低的對照組之間，證實了上述理論。

綜上所述，血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ水平變化在病毒性心肌炎發病中有重要作用，可在臨床作為病情判斷及療效評價的參考指標。

參考文獻

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(收稿日期：2016-01-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.045

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1119-02