水楊酸對打頂后煙草根系鉀吸收的調控作用研究

楊　亞，趙杰宏，姜　驍，母應春，蘇　偉*

(1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省煙草科學研究院煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴州 貴陽 550081)

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水楊酸對打頂后煙草根系鉀吸收的調控作用研究

楊亞1，趙杰宏2，姜驍1，母應春1，蘇偉1*

(1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省煙草科學研究院煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴州 貴陽 550081)

摘要：為探索打頂后煙草根系鉀素的分配和轉移規律，試驗研究了打頂及施用不同濃度水楊酸對根系鉀吸收及鉀運輸相關基因表達水平的影響。結果發現，打頂減少煙草根系對鉀的吸收，而打頂同時施加水楊酸會影響根系吸收鉀，其中5 μmol/L的水楊酸能提高打頂后根系鉀吸收，而施加較高濃度水楊酸則效果相反。另外，各處理前后根中鉀運輸基因“NTORK1/HAK1”表達比值差異和根系鉀吸收能力差異基本一致，可能受水楊酸的調控，可用作打頂后煙草鉀素的分配和轉移的間接評價指標。

關鍵詞：煙草；鉀；打頂；水楊酸

引言

水楊酸(salicylic acid，SA)，即鄰羥基苯甲酸，是植物體內廣泛存在的小分子酚類化合物。水楊酸可提高植物對脅迫的抗性，如能夠誘導煙草抵抗野火病[1]，在弱光[2]、低溫[3]、金屬Cu[4]等脅迫下也發揮顯著作用。在擬南芥中，水楊酸能抑制鹽脅迫導致的鉀外流[5]。鉀作為植物最重要的大量元素之一，是60多種酶的活化劑，參與植物體內滲透壓的維持、同化產物的運輸，同時還促進光合作用[6-7]。鉀可提高煙葉燃燒性、減少煙氣中總粒相物和焦油含量[8-9]。鉀在根部的分配和轉移是由鉀離子通道和載體介導，擬南芥中幾個鉀通道基因已被鑒定，其中AKT1與AtKC1一起參與根毛鉀的吸收[10-12]。煙草鉀通道基因NKT1、NtKC1和鉀吸收轉運體NtHAK1也已被克隆，而NTORK1則是煙草主要的鉀外流通道基因[13-14]。打頂是煙葉生產中一項重要的農藝措施，可以減少營養消耗，促進上部葉生長，提高煙葉產量和質量。但打頂會導致煙株鉀流失[15]，因而，減少打頂等造成煙株鉀離子的重分配和流失一直是人們關注的焦點。通過施加能調節根系鉀吸收的植物生長調節劑，并研究其機理，將為改善煙株養分利用、提高煙株鉀含量提供依據。

對于快遞包裝回收，國家有關部門制定了一個時間表。2017年，國家十部門聯合發布的《關于協同推進快遞業綠色包裝工作的指導意見》明確，到2020年，可降解的綠色包裝材料應用比例將提高到50%，基本淘汰重金屬等特殊物質超標的包裝物料，基本建成專門的快遞包裝物回收體系。主要快遞品牌協議客戶電子運單使用率達到90%以上，平均每件快遞包裝耗材減少10%以上，推廣使用中轉箱、籠車等設備，編織袋和膠帶使用量進一步減少。基本建立快遞業包裝治理體系。2019年1月1日實施的《電商法》中第五十二條規定，快遞物流服務提供者應當按照規定使用環保包裝材料，實現包裝材料的減量化和再利用。

1材料與方法

1.1材料、試劑和培養液

煙草品種為 K326(Nicotianatabacumcv. K326)；水楊酸(SA)購自Sigma。植物總RNA提取試劑盒購自天根；PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA反轉錄試劑盒、SYBR Premix DimerEraserTM均購自Takara。

Hoagland基礎營養液：1.2 mmol/L KNO3；0.8 mmol/L Ca(NO3)2；0.2 mmol/L NH4H2PO4；0.2 mmol/L MgSO4；50 μmol/L KCl；12.5 μmol/L H3BO3；1 μmol/L MnSO4；1 μmol/L ZnSO4；0.5 μmol/L CuSO4；10 μmol/L Fe-EDTA；0.1 μmol/L H2MoO4。

建筑信息模型是一切BIM工作的源泉，數據和信息是一切施工管理工作的基礎，有“模型”才有數據和信息（見圖2～圖7）。

1.3總RNA提取及反轉錄

1.2煙草水培及水楊酸處理

由圖1可見，煙草打頂后，鉀離子的濃度在30 min時達到一個峰值，隨后隨時間的增加而逐漸下降，但打頂處理后培養液的鉀離子濃度始終高于不打頂處理的濃度。不同濃度SA對根系鉀有不同的效果。打頂加50 μmol/L SA處理的培養液鉀離子濃度高于打頂處理(除了30 min)，且隨著時間變化先降低后升高，在3 d左右達到一個峰值；對于打頂加10 μmol/L SA和打頂加5 μmol/L SA處理，培養液中鉀離子濃度隨時間增加而逐漸降低，但打頂加10 μmol/L SA處理的鉀離子濃度高于打頂處理的濃度(除30 min外)，而打頂加5 μmol/L SA處理的鉀離子濃度在30 min以后一直處于打頂和不打頂處理之間。這表明，打頂會降低煙草根系鉀吸收，低濃度SA(5 μmol/L )處理能夠促進打頂后根系對鉀的吸收，而較高濃度的SA(50 μmol/L )效果相反，甚至導致鉀流失。

Hoagland低鉀營養液：在基礎營養液中，分別用0.6 mmol/L Ca(NO3)2和50 μmol/L CaCl2替換1.2 mmol/L KNO3和50 μmol/L KCl。鉀濃度用KCl調節。

2.3NTORK1/HAK1表達與根系鉀吸收的相關分析

（2）評價內容多維化。職業標準的項目比重表包括理論知識和技能兩個方面。比重表反映了各項工作內容在培訓考核中所占的比例。國際商法課程考核應基于職業標準的項目權重，對學生的理論知識、技能操作、基本素質和外語水平進行全面考核。如，根據《報關員國家職業標準（試行）》，理論知識和技能操作各占50%。在100分的理論知識中，職業道德和基礎知識占15%，報關英語占5%，其他專業知識占80%。由于職業標準是考慮職業需要，而非考慮高等院校的不同特點而制定，鑒于高職教育的特殊性，在實際課程考核評價中，技能操作所占的比重還可以大大提高。

對鉀運輸基因NTORK1(AB196792)、HAK1(DQ841950)和NtKC1(AB196791)進行實時熒光定量分析，定量PCR引物見表1。以煙草β2-ACTIN(AB158612)為內參基因。以cDNA為模板，按照SYBR Premix DimerEraserTM(Toyobo，Japan)說明書操作，在ABI Stepone Plus(Applied Bio-systems，美國)上進行反應。PCR體系為：10 μL SYBR Premix DimerEraserTM，0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL cDNA(<100 ng)，10 μmol/L上下游引物各0.6 μL，ddH2O補足20 μL。反應程序為 95℃ 60 s；40個循環(95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)。反應結束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。設樣本和內參各3個重復，采用ΔΔCt相對定量法分析數據，即目的基因相對表達量=2-ΔΔCt。

其中，ΔΔCt=(實驗組ΔCt)-(對照組ΔCt)，實驗組ΔCt=(實驗組目的基因Ct)-(實驗組內參基因Ct)，對照組ΔCt=(對照組目的基因Ct)-(對照組內參基因Ct)，2-ΔΔCt表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數。

表1　實時熒光定量PCR引物

2結果與分析

2.1水楊酸對打頂后煙草根外鉀離子的影響

分別對30 min、3 h和3 d時不打頂、打頂加5 μmol/L SA和打頂三種處理煙草的根和葉進行取樣，并提取RNA反轉錄成cDNA進行實時熒光定量PCR分析。由圖2可知，PCR產物電泳為單帶且位置大小正確，HAK1、NtKC1和NTORK1三個基因的熔解曲線都為單峰曲線，實驗條件符合定量PCR需要(圖2A和2B)。

煙草種子播種于盛有煙草專用育苗基質和蛭石(5∶2)混合的漂浮盤中，生長至5片真葉時，選取生長均勻一致的煙苗在自來水中輕緩洗凈根部，然后移入10升裝有1/4 Hoagland基礎營養液的培養盆中連續通氣培養，每3 d更換1次營養液。待煙苗緩苗后選取煙葉正常生長且均勻一致的煙苗移至內徑為7.5 cm，高為7 cm的塑料杯中，每杯1株，用Hoagland低鉀營養液通氣水培，供鉀水平為0.1 mmol/L。煙苗長至六葉一心時，在低鉀水培條件下，設置如下5個處理：不打頂，打頂，打頂加5 μmol/L SA，打頂加10 μmol/L SA，打頂加50 μmol/L SA。其中SA均加入低鉀營養液中，打頂為去掉頂部一葉一心。并在0 min，10 min，20 min，30 min，1 h，3 h，7 h，1 d，3 d，5 d時間段取出培養液，用火焰光度法檢測培養液中的鉀含量。試驗重復3次。

圖1　不同處理下培養液鉀離子濃度的變化

2.2打頂對鉀運輸基因表達的影響

烏江風情廊道是烏江流域旅游資源聚集區，具有資源稟賦品級高、質量優、分布廣、密度大等特點，具有良好的利用開發條件，有利于文化旅游產業集群化發展。

1.4鉀通道基因表達水平分析

以不打頂作為對照，比較HAK1、NTORK1和NtKC1的相對表達水平(圖3A、B和C)。由圖3可知，HAK1在葉中表達比較高，且打頂加SA在3 h表達最高，但HAK1在根中的變化平穩；NTORK1在3 h表達量相對比較高；NtKC1在根和葉的表達量分別在3 h和3 d相對較高。但作為根系主要的吸鉀基因(HAK1)和排鉀基因(NTORK1)，其表達隨時間變化趨勢如何關聯根系鉀吸收變化，仍需進一步研究。

圖2　各鉀運輸基因定量條件

(A)

(B)

(C)

對各處理煙株的根和葉分別進行取樣，在液氮中速凍后，采用天根總RNA提取試劑盒方法提取煙草總RNA，然后以Oligo(dT)為引物，按照寶生物cDNA合成試劑盒的操作說明合成cDNA第1鏈。

3) 0—2狀態轉換。能造成該轉換的情況有一種：2個通道中任意1個通道發生非共因失效下的FDU，其概率為

為了進一步了解打頂和SA處理后根系鉀變化趨勢與“NTORK1/HAK1”變化趨勢的關系，分析了不同處理下根和葉中“NTORK1/HAK1”表達水平比值隨時間的變化(圖4)。根中打頂和打頂加5 μmol/L SA兩種處理導致“NTORK1/HAK1”表達水平比值上升，與相應處理中根系鉀吸收低于不打頂處理的結果一致，而煙葉中“NTORK1/HAK1”比值的變化趨勢與根系相反。這說明，根系 “NTORK1/HAK1”的比值變化可以在一定程度上說明根系鉀吸收的差異，但是低濃度SA在促進打頂后煙草根系對鉀的吸收過程中，是調節了NTORK1還是HAK1并未清楚，還需進一步研究。

異步協作模式類似圖1維基百科的“引用—改進”模式：設計師公開發布方案供其他人引用，同時可以引用任何公開發布的方案進行修改和提交新方案。考慮到產品設計的實際情況，該模式允許用戶引用任何一款設計方案，而不一定是最新一輪方案。

(A)

(B)

3結論與討論

煙草打頂后植株體內物質的變化近年來一直是研究熱點。代曉燕等[16]報道打頂能夠降低煙葉內IAA、ABA、GA3和ZR的含量，刺激根中IAA、ABA、GA3和ZR含量的增加。鄒焱等[17]證明打頂對煙株中GA3、ABA和IAA含量均有較大的影響，能增加煙葉和根中GA3和ABA含量，而明顯降低IAA含量。Fu等[18]表明打頂增加了煙草根部生長素的濃度。這表明打頂會引起煙株內源激素的變化，打破內源激素的平衡。鄭憲濱等[15]研究表明打頂后煙草鉀會重新分配和轉移，鉀會外排。減少打頂造成鉀素的分配和轉移是我們一直關注的重點。洪麗芳等[19]采用86Rb標記示蹤原子法研究了烤煙打頂傷口添加NAA后煙草中鉀元素的再循環再分配情況，結果表明打頂傷口涂抹NAA后有利于鉀在葉片的積累，NAA參與鉀運輸的調控過程。陳迪文[20]研究表明打頂會導致煙葉中鉀含量下降，噴施調節劑后有利于鉀在煙葉中的累積，使煙葉的鉀含量得到提升。Jayakannan等[5]發現在擬南芥中，SA能抑制鉀通道GORK在鹽脅迫下導致的鉀外流。因此通過施加植物生長調節劑，并研究根外鉀對改善煙葉質量有很大的理論和應用價值。本研究結果發現，打頂降低根系鉀吸收，施加5 μmol/L SA能提高打頂后煙草根系對鉀的吸收，而較高濃度的SA(10 μmol/L和50 μmol/L)效果相反。

激素對鉀運輸的調控作用一直受人們關注。Gaymard等[21]報道了SKOR的表達受脫落酸(ABA)的抑制。Becker等[22]研究表明脫落酸(ABA)誘導保衛細胞質膜去極化和GORK表達，GORK介導的鉀離子流出也受誘導。Coskun等[23]指出在低鉀濃度0.1 mmol/L下，鉀是通過鉀通道介導外流。Sano等[14]研究表明5.4 μmol/L NAA可使細胞分裂，且誘導NTORK1的表達。Armengaud等[24]提出鉀缺乏時茉莉酸(JA)生物合成酶，脂氧合酶等酶的轉錄水平顯著增加。Philippar等[25]表明生長素通過增加鉀離子通道密度誘導了玉米ZMK1基因的表達。這些研究結果都表明生長素參與了鉀離子缺乏響應以及鉀離子攝取。在本實驗中通過對鉀運輸基因NtKC1、HAK1和NTORK1實時定量分析，發現根系中“NTORK1/HAK1”比值與根對鉀吸收能力的差異基本一致，這可推測SA可能是通過“NTORK1 和HAK1”的表達比來調節根系鉀吸收，但是其他鉀運輸通道參與作用的方式和水平，以及SA在調節煙草根系鉀吸收的過程中是調節了NTORK1還是HAK1并未清楚，還需進一步研究。

綜上所述，本文研究了水楊酸對打頂后煙草根系鉀吸收的調控作用，其結果表明，煙草打頂可降低煙草根系鉀吸收，而打頂同時施加水楊酸可以改變根系吸收鉀的能力。當施加SA濃度為5 μmol/L時，能夠提高根系對鉀的吸收，而較高濃度的SA(10 μmol/L和50 μmol/L)效果相反。在打頂加5 μmol/L SA和打頂兩個處理中，HAK1和NTORK1基因的表達水平變化趨勢基本一致，且在處理前后根和葉中鉀運輸基因“NTORK1/HAK1”比值的變化趨勢和根系鉀吸收的趨勢基本一致，尤其是根系中“NTORK1/HAK1”的比值。這說明，打頂導致根系鉀吸收減少，這個過程受SA的調控，并且可以由根系中“NTORK1/HAK1”的比值變化初步表征。

參 考 文 獻：

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The effect of salicylic acid regulation after topping on potassium absorption by tobacco roots

YANGYa1,ZHAOJie-hong2,JIANGXiao1,MUYing-chun1,SUWei1*

(1.CollegeofLifeScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.KeyLaboratoryofMolecularGeneticsofCNTC,GuizhouAcademyofTobaccoScience,Guiyang,Guizhou550081,China)

Abstract：In order to understand the potassiumdistribution and transfer in tobacco roots after topping, the effect of topping alone and toppingtogether withdifferent concentrations of salicylic acid regulation on expression of the genes related to potassium absorption and transfer by tobacco roots was studied. Topping alone of tobacco decreased the potassium absorption in root, while topping together with applying salicylic acid could affect the trend of potassium absorption in roots.Application of 5 μmol/L of salicylic acid increased potassium absorption.However, higher concentrations of salicylic acid resulted in the opposite effects, i.e. reducing the potassium absorption. In addition, there was similarity between the ratio of the genes "NTORK1/HAK1" and the difference of ability of potassium absorption in tobacco roots, indicating that the expression of NTORK and HAK1 may be regulated by salicylic acid,which can be used as an indirect index for potassiumdistribution and transfer in root after topping.

Keywords：Tobacco; Potassium; Topping; Salicylic acid

文章編號：1008-0457(2016)01-0045-06國際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.010

中圖分類號：S572

文獻標識碼：A

通訊作者：蘇偉(1974-)，男，博士，副教授，主要研究方向：應用生物技術研究；E-mail：suwei1886@163.com。

基金項目：中國煙草總公司科技重大專項項目(110201401007(JY-07))；貴州省農業攻關科技計劃(黔科合NY[2013]3020號)；貴州省科技廳農業攻關項目(黔科合NY[2013]3052號)。

收稿日期：2016-01-06；修回日期：2016-02-08