重組精氨酸脫亞胺酶的制備工藝

何云鳳,郭晉霞，范　開

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶　400054;2.重慶富進生物醫藥有限公司，重慶　400050)

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重組精氨酸脫亞胺酶的制備工藝

何云鳳1,郭晉霞1，范開2

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶400054;2.重慶富進生物醫藥有限公司，重慶400050)

摘要：研究了重組精氨酸脫亞胺酶(rADIES)的30 L規模發酵、制備工藝及其生物學活性。將構建好的工程菌先進行搖瓶活化獲得種子液，轉入30 L發酵罐進行培養，用IPTG進行誘導表達；表達產物進行高壓勻漿破菌、包涵體洗滌、溶解稀釋復性后經DEAE陰離子交換層析柱和Butyl疏水層析柱純化；通過SDS-PAGE和RP-HPLC等方法檢測表達和純度；用體外測活法檢測活性。將工程菌進行放大培養并誘導表達，獲得了相對分子質量在46 kDa的rADIES。重組蛋白表達量占總蛋白的25%以上，經制備工藝獲得的rADIES純度高于95%，酶活性為42 IU。實驗結果表明：該工藝具有可行性，可以獲得較高活性的重組精氨酸脫亞胺酶。

關鍵詞：精氨酸脫亞胺酶；發酵；復性；分離純化

精氨酸脫亞胺酶(rginine deiminase,ADI，EC3.5.3.6)是一種可以將L-精氨酸不可逆分解為L-瓜氨酸和氨的酶[1]，最先在支原體Mycoplasmaarginini中發現。目前研究得最多、最深入的也是來源于支原體的ADI，此后，在其他細菌和少數低等真核生物中也有發現[2]。研究證實，ADI可以抑制很多精氨酸營養缺陷型腫瘤細胞(如肝細胞癌、黑色素瘤細胞、前列腺癌、膠質母細胞癌等)的生長，而對正常人體細胞沒有影響[3-4]。其抑制機制主要包括兩方面：其一是降低血清中的精氨酸，正常細胞和組織中存在精氨酸琥珀酸合成酶(ASS) 和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)兩種酶，經尿素循環可以自身合成精氨酸，而精氨酸營養缺陷型腫瘤細胞自身不能表達ASS，必須從血液中獲得精氨酸合成自身需要的蛋白質，ADI一旦降解血清中的精氨酸，最終將導致腫瘤細胞死亡[5-6]；其二是可以抑制血管內皮細胞的合成，減少腫瘤新生血管的生成[7]。因此，ADI具有開發成抗腫瘤藥的潛力。

目前在制備ADI時主要從支原體中提取[8]或采取基因工程方法在大腸桿菌中表達和制備[9-12]。美國polaris公司正在制備的臨床II-III期抗腫瘤的PEG化ADI(PEG-ADI20)是兩個突變的支原體ADI(ADIES)。本研究主要探討該突變ADI(ADIES)放大制備工藝和活性，為進一步進行PEG修飾和臨床研究并實現產業化奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

攜帶有質粒pET-ADIES的BL21工程菌種(pET-ADIES/ BL21)為重慶派金生物科技有限公司構建保存；中分子蛋白標準來自TIANGEN公司；Bio-Rad Universal 電泳儀購自美國Bio-Rad；TU-1810 紫外可見分光光度計購自北京普析；高速冷凍離心機購自日本日立；DEAE Sepharose Fast Flow和Butyl Sepharose 4 Fast Flow層析填料(General Electric Company)；TSK-GEL G3000SWxL Column購自TOSOH公司；Waters Symmetry 300 C18購自沃特世公司；Superdex 100 Column (General Electric Company)；Agillent 1200 型高效液相色譜儀(Agilent Technologies)；LB培養基和M9-YT培養基均參照Novagen公司pET操作手冊配置；其余化學試劑均為常規試劑。

1.2方法

1.2.1重組ADIES的表達

將工程菌種(pET-ADIES/ BL21)從-80 ℃冰箱中取出迅速融化，接種于250 mL/瓶含氨芐青霉素100 μg/mL LB培養基中，共接種4瓶。于30 ℃、180 r/min搖床培養過夜，直至OD值達到1左右即可獲得種子液。將2 L種子液全部接入18 L M9-YT培養基開始發酵，pH值維持在7.0左右，通氣量維持在10 L/min。加入種子液后pH值和溶氧開始下降，待培養基中葡萄糖消耗完畢后溶氧瞬間升至最高點，pH值開始上升，此時流加補料。流加補料1.5 h后OD值達10左右，加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG開始誘導。此時停止加補料，0.5 h后開始流加補料(溶氧維持在40%)，誘導4 h后下罐，離心收集菌體。將收集的菌體留樣通過SDS-PAGE分析檢測表達量，其余菌體凍存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2重組ADIES高壓勻漿破菌

按1∶10(m/V)的比例將菌體溶于破菌緩沖液(50 mmol/L PB、pH值為8.0的1 mmol/L EDTA)中以200～300 r/min室溫攪拌均勻后，在20，40，70 MPa壓力條件下各循環1次進行低溫高壓勻漿。采用顯微鏡觀察破菌效果，當破菌率達95%以上即可用高速冷凍離心機在8 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，收集沉淀。

1.2.3重組ADIES包涵體的洗滌

本研究采用高壓勻漿破菌法破菌后分別按照以下洗滌方式各洗滌一次。洗滌緩沖方式1：50 mmol/L PB、1mmol/L EDTA、1%Triton X-100、pH值為8.0；洗滌緩沖方式2：50 mmol/L PB、1 mmol/L DTT、2 mol/L Urea、0.15 mol/L NaCL 、pH值為8.0；洗滌緩沖方式3：50 mmol/L PB、1 mmol/L DTT、pH值為8.0。按以上條件洗滌后經高速冷凍離心機在 8 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，收集沉淀。

1.2.4包涵體變性溶解及復性

按照1∶10(m/V)的比例將包涵體沉淀溶解于變性溶解緩沖液(20 mmol/L PB、6 mol/L鹽酸胍、10 mmol/L DTT、pH值為8.0)中。磁力攪拌(300 r/min)助溶過夜。高速冷凍離心機8 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，棄沉淀收集上清。采用稀釋復性法復性，按照1∶20 (V/V)的比例將收集的上清液稀釋到復性液(50 mmol/L PB、0.1% PEG4000、20 mmol/L NaCL、pH值為7.0)中，并于4℃復性48 h。

1.2.5重組ADIES蛋白純化

1) DEAE柱純化。填裝DEAE Sepharose Fast Flow填料500 mL，按照常規方法清洗柱子。用平衡液(20 mmol/L PB、pH值為7.0)平衡2～3個柱體積，蠕動泵50 r/min快速上樣，在用平衡液進行復平衡2～3個柱體積后，改用洗脫液1 (20 mmol/L PB、0.1 mol/L NaCL、pH值為7.0)沖洗雜蛋白，用洗脫液2(20 mmol/L PB、0.3 mol/L NaCl、pH值為7.0)洗脫目的蛋白。

2) Butyl柱純化。填裝Butyl Sepharose 4 Fast Flow填料400 mL，常規方法清洗柱子。用平衡緩沖(20 mmol/L PB、2 mol/L NaCL、pH值為7.0)平衡2～3個柱體積后，將DEAE洗脫目的蛋白樣補加終濃度為2 mol/L NaCl后上樣，平衡緩沖(20 mmol/L PB、2 mol/L NaCL、pH值為7.0)進行復平衡2～3個柱體積至電導平穩為止，改用洗脫液1(20 mmol/L PB、0.5 mol/L NaCL、pH值為7.0)洗去雜蛋白，用洗脫液2(20 mmol/L PB、0.1 mol/L NaCL、pH值為7.0)收集目的蛋白。

1.2.6酶活性測定

1) L-瓜氨酸標準曲線的建立。取1 mmol/L 的L-瓜氨酸溶液，用0.1 moL/L PB、pH值為7.0的緩沖液稀釋成0，50，100，150，200，250，300，350，400，450，500 μmol/L梯度溶液。

2) 樣品的處理：用0.1 mol/L PB分別稀釋成1 μg/mL和2 μg/mL溶液。在試管中加入上述稀釋好的溶液1 600 mL,用0.1 mol/L PB緩沖液200 μL 混勻。每個樣做1個平行復孔。放置于37 ℃水浴鍋中預熱5 min。加入0.1 mol/L精氨酸200 μL混勻，置37 ℃水浴鍋中精確反應5 min，再于100 ℃金屬浴中停止反應5 min，取出降至室溫。

3) 顯色：在標準曲線和處理后的樣品試管中依次加入3 mL混合酸-鐵溶液，混勻。再加入0.5 mL/管的顯色液混勻，立即放入100 ℃金屬浴中反應10 min。每管平行操作20 s。反應結束后取出在自來水中降至室溫，等待測定。

4) 活性測定：取150 μL反應溶液于酶標板內，波長490 nm測定其吸光度值，記錄數據，繪制L-瓜氨酸標準曲線，計算待測樣品比活性。

2結果與分析

2.1工程菌的發酵

本實驗通過前期已構建的工程菌種(Pet-ADIES/BL21)進行30 L放大培養，收獲濕菌體550 g，成功實現了精氨酸脫亞胺酶以包涵體形式在大腸桿菌中高表達。從圖1可以看出：工程菌在放大培養過程中呈大腸桿菌的桿狀。表達產物經SDS-PAGE分析可得目標蛋白相對分子質量約為46 kDa，位置與理論值一致。通過凝膠成像掃描軟件分析，目標蛋白占全菌蛋白的25%以上，如圖2所示。

圖1　誘導3 h后顯微鏡分析

1.未誘導全菌; 2.IPTG誘導1 h全菌; 3.IPTG誘導2 h全菌;

2.2高壓勻漿破菌

目前已有文獻報道，精氨酸脫亞胺酶菌體均采用超聲破菌，而在工業上這種方法費時費力，并不能滿足工業需求。本研究初次采用效率較高的高壓勻漿法破菌，破菌率達95%以上。

2.3重組蛋白的純度檢測

本實驗通過兩步柱純化，純化產物用SDS-PAGE和RP-HPLC方法分析純度， 用SEC-HPLC方法分析高分子含量。其中SDS-PAGE采用12%的分離膠，考馬斯亮藍染色，用凝膠成像系統分析。RP-HPLC分析條件：分析柱采用Waters Symmetry 300 C18柱，以含0.1%的三氟乙酸為流動相A液，以95%的乙腈溶液為流動相B液，進樣量10 μL，檢測波長214 nm，流速1 mL/min，分析時間30 min。SDS-PAGE分析結果見圖3，RP-HPLC分析結果見圖4。主峰ADIES在C18柱上的保留時間為20.442 min，純度為99.6%。 SEC-HPLC分析條件：采用Superdex100柱子，以20 mmol/L PB、 pH值為7.0作為流動相，流速0.5 mL/min，檢測波長280 nm，分析時間30 min，進樣量20 μL。結果如圖5所示，只出現目的條帶單峰，目的蛋白的保留時間為16.446 min，未檢測目的峰意外的其他峰。

1.DEAE柱洗脫主峰; 2.DEAE柱洗脫雜峰;

圖4　純化ADIES的PR-HPLC圖譜

圖5　純化ADIES的SEC-HPLC圖譜

2.4酶活性測定

酶活性定義：在最適反應溫度為37 ℃、pH值為7.0條件下，1 min內轉化1 μmoL L-瓜氨酸所需的酶量稱為一個國際單位(IU，又稱U)。

測活原理：精氨酸在精氨酸脫亞胺酶的作用下生成L-瓜氨酸，根據L-瓜氨酸在強酸性溶液中與二乙酰一肟的專一性顯色反應及反應復合物在490 nm處吸光度與L-瓜氨酸濃度呈線性梯度關系的特點，建立一種準確、快速、簡便、靈敏的重組蛋白活性測定方法。

經過純化后的ADIES樣品，采用本文所述的方法進行測活。L-瓜氨酸標準曲線如圖6所示，依據該曲線繪制的線性方程為y=0.003 3x=0.007 5(x代表瓜氨酸濃度，y代表對應OD值)，R2= 0.999 7，線性結果較為理想。待測活樣品按照本文所述方法進行測活，代入公式計算，獲得的酶活性為42 IU。

圖6　L-瓜氨酸標準曲線

3結束語

某些營養缺陷型腫瘤細胞(如肝細胞癌、黑色素瘤細胞、前列腺癌、膠質母細胞癌等)的生長對精氨酸具有依賴性，而正常細胞沒有這種依賴性，精氨酸脫亞胺酶通過降解體內精氨酸達到治療腫瘤的目的[13]。

本研究前期，已構建出表達目的蛋白的工程菌，通過30 L體系發酵培養，采取IPTG誘導方式獲得目標蛋白的包涵體，可獲得約550 g的濕菌體。SDS-PAGE分析結果表明：目標基因能夠在E.Coli中獲得高效表達，產物的相對分子質量在46 kDa左右，與理論分子量一致。由于重組ADIES蛋白是以包涵體的形式表達，在包涵體中除了含有目的ADIES蛋白外，仍含有大量宿主菌蛋白和核酸類雜質。通過對包涵體進一步洗滌提純，不僅能有效提高蛋白復性效率、降低純化工藝難度，而且能顯著提高目的蛋白回收率。本工藝每100 g濕菌菌體經高壓勻漿法破菌后可獲得約25 g包涵體沉淀。包涵體經洗滌后，每25 g可獲得10 g純度較高的包涵體沉淀。經復性、DEAE Sepharose Fast Flow和Butyl Sepharose 4 Fast Flow等工藝流程，可獲得SDS-PAGE和RP-HPLC純度均不低于95%的目標蛋白，每100 g可獲得1 g以上的重組精氨酸脫亞胺酶。經過體外測活法進行測活，測得的酶活性高達42 IU。

目前由美國polaris公司開發的聚乙二醇修飾精氨酸脫亞胺酶(ADI-PEG 20)正在進行臨床3期的研究實驗。這種酶是一種外源蛋白，用于人體會出現嚴重的免疫原性。目前普遍采用的方式是進行PEG修飾，降低免疫原性和延長半衰期[14]。本實驗通過中試規模的制備放大研究，獲得了高純度高產量的精氨酸脫亞胺酶，為后期進一步PEG修飾研究、藥理和藥效學研究等奠定了基礎，具有一定的實際應用前景。

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(責任編輯何杰玲)

Study of Preparation Technology of Recombinant Arginine Deiminase

HE Yun-feng1, GUO Jin-xia2, FAN Kai2

(1.College of Pharmacy and Biological Engineering, Chongqing University of Technology,Chongqing 400054, China; 2. Fagen Techenology Inc., Chongqing 400050, China)

Abstract:The 30 L scale fermentation, preparation technology and biological activities of recombinant arginine deiminase (rADI-ES) were investigated. The seed solution was obtained by shaking flask activation of the constructed engineering bacteria, and then transferred it to 30 L fermenter for enlarging cultivation, and IPTG was used for its induction expression. The expression products broke bacterium by high-pressure homogenizer, and inclusion bodies were washed by buffer, and after dissolved refolding, the product was purified with DEAE anion exchange chromatography and Butyl hydrophobic interaction chromatography column, and we detected its expression and purity by SDS-PAGE and RP-HPLC analysis. The activity of rADI-ES was determined in vitro. We successfully amplified and induced expression of the engineering bacteria, and obtained the rADIES with the molecular weight of 46 kDa. The expression quantity of recombinant protein counts about more than 25% total protein, and the purity of the purified rADI-ES is more than 95% and its enzymatic activity is 42 IU. The expeiment show that the process is feasible to obtain a higher purity and activity of recombinant arginine deiminase.

Key words:arginine deiminase; fermentation; refold; purification

文章編號：1674-8425(2016)04-0073-06

中圖分類號：Q3441.13

文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.04.013

作者簡介：何云鳳(1987—)，男，重慶云陽人，碩士研究生，主要從事基因工程制藥研究。

收稿日期：2016-01-11

引用格式：何云鳳,郭晉霞，范開.重組精氨酸脫亞胺酶的制備工藝[J].重慶理工大學學報(自然科學)，2016(4):73-78.

Citation format：HE Yun-feng, GUO Jin-xia, FAN Kai.Study of Preparation Technology of Recombinant Arginine Deiminase[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2016(4):73-78.