兩種化學發光法測定乙肝五項性能評估

王　軍，劉妮妮，趙　權，葉琳琳，劉　婧，劉玉琳，徐　菲

兩種化學發光法測定乙肝五項性能評估

王軍，劉妮妮，趙權，葉琳琳，劉婧，劉玉琳，徐菲

［關鍵詞］光激化學發光法；乙型肝炎；定量分析

光激化學發光法（light initiated chemiluminescence assay，LICA）是以納米級高分子微粒為載體的免疫化學發光技術，本研究對該方法與化學發光微粒免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）檢測乙型肝炎病毒（HBV）感染的血清學標志物的結果做比較，以分析該方法檢測性能與CMIA的符合程度及對臨床診斷的影響。

1　材料和方法

1.1儀器、試劑及檢測樣本收集1015例疑似HBV感染者靜脈血，分離血清待測；收集乙肝五項同時為陰性（經CMIA篩查）的一個血清盤。光激化學發光法的儀器（LiCA HT高通量免疫分析儀和LiCA SP全自動移液器）和試劑，均為上海博陽生物科技有限公司產品；化學發光微粒免疫分析法的儀器（ARCHITECT i2000SR）和試劑，均為美國雅培公司產品；相關試劑批號如下：

雅培試劑批號：HBsAg（26057LF00）；HBsAb （27235LF00）；HBeAg（24065LI00）；HBeAb（24512L I00）；HBcAb（22362LI00）。

博陽試劑批號：HBsAg（A1019）；HBsAb（A1020）；HBeAg（A1021）；HBeAb（A1021）；HBcAb（A1021）。

1.2結果判斷標準（1）雅培結果判斷標準：HBsAg＞0.05 IU/mL；HBsAb＞10 mIU/mL；HBeAg＞1 S/CO；HBeAb＜1 S/CO；HBcAb＞1 S/CO。（2）博陽結果判斷標準：HBsAg＞0.2 ng/ml；HBsAb＞10 mIU/ml；HBeAg＞1 PEIU/ml；HBeAb＞2 PEIU/ml；HBcAb＞5.3 PEIU/ml。

1.3評價方法

1.3.1精密度根據EP5-A文件中關于實驗方案的要求，應對標本每天做2批實驗，批間相隔的時間不少于2 h，每批對樣品進行雙份測定，20 d后得到80個結果，共40對。每次檢測前，分別取出HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的陰性血清盤、低值質控品QL和高值質控品QH，室溫放置30 min后再上機檢測。按EP5-A文件的要求對檢測結果進行統計分析，計算CV值。

1.3.2回收率測定分別取上海博陽生物科技有限公司提供的HBsAg、HBsAb 6點定標液各200 μl，按濃度梯度分別加入5個試管中，0濃度管為空白，不加定標液；隨機取一份HBsAg陽性血清和HBsAb陽性血清，通過光激化學發光法分別測其濃度，然后將兩份血清各200 μl分別加入已知濃度的試管中，每管重復測量2次，取其均值，以各濃度點的實測平均值占其理論期望值的百分數計算其回收率。

1.3.3檢測結果比較通過兩種方法對1015例HBV感染者臨床樣本的平行檢測，以雅培CMIA為參考對象來評估博陽LICA方法檢測的乙型肝炎病毒5項血清學指標與CMIA檢測結果的符合率。

1.4統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件，曲線擬合采用3次樣條曲線擬合，對兩種方法檢測結果差異的顯著性比較采用配對χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1工作曲線對不同檢測項，取同一批號不同靶值的定標品連續檢測5 d，2次/d。曲線擬合采用3次樣條曲線擬合，根據各自的均值繪制工作曲線，r2＝0.998。

2.2試驗性能評價

2.2.1精密度檢測LICA五項血清學標志精密度結果見表1、2。

表1　LICA乙肝五項低值質控品精密度

表2　LICA乙肝五項高值質控品精密度

2.2.2回收率測定不同濃度HBsAg、HBsAb的回收率見表3、4，HBsAg平均回收率為100.16% （96.81%～102.69%）；HBsAb平均回收率為99.7% （95.85%～104.55%）。

表3　不同濃度的HBsAg回收率

表4　不同濃度的HBsAb回收率

2.2.3兩種方法檢測結果比較見表5。

表5　LICA與CMIA檢測HBV感染5項血清學標志結果比較

3　討　論

LICA檢測原理源于90年代問世的單線態氧分子能量傳遞發光免疫分析技術［2-4］，該技術采用了納米級顆粒，大大增加了生物分子的包被面積，同時借助鏈霉親和素-生物素放大系統，使單位體積反應體系中含有更高濃度的生物分子，為實現超高敏感性，減少樣本和試劑用量奠定了基礎。另外，這種納米顆粒在液相中保持穩定的懸浮狀態，并借助于結合則發光原理，實現了均相免清洗檢測，和其他化學發光法相比具有如下特點：（1）LICA反應體系為均相反應，傳統免疫檢測技術多為非均相反應，非均相反應具有反應不充分、反應時間長、反應體系溫度均一性差的缺點，而LICA整個反應是在均相中進行的，均相具有反應充分、反應時間短、反應體系溫度均一性好的優點，顯示出該方法具有很高的精密度；（2）LICA另一個特點是免清洗，由于在均相中反應，加上其獨特的檢測原理結合則發光，所以檢測過程無須進行清洗分離，則能有效降低檢測過程中的隨機誤差和交叉污染，最大限度地提高了檢測的準確度；（3）LICA樣本及試劑用量微量化，每項樣本及試劑用量僅25 μL，隨著樣本用量地大幅減少，使得檢測小型化芯片化和高通量成為可能；（4）LICA超敏感性，由于采用了納米級微粒，增加了反應表面積，縮短了反應時間，使檢測的敏感性大大提高。有文獻報道，該方法對可能存在的干擾物質，如單線態氧淬滅物質（抗氧化劑、血紅蛋白、維生素C等）生物素結構類似物如總膽紅素、三酰甘油等具有較好的耐受能力，少數物質在較高的濃度時的確存在干擾，但在常規濃度情況下，這些干擾作用可以忽略不計，表現出較高的特異性［5-7］以CMIA為參照，LICA對1015例臨床樣本檢測結果顯示，2種檢測方法對檢測結果的符合率分別為99.9%、99.7%、99.8%、99.51%、99.7%，具有很高的一致性，而作為輔助指標的抗HBe和HBeAg存在一定差異，其中兩者不符的樣本多處于灰區弱陽或弱陰范圍，導致差異的原因是由于2種方法在抗HBe和HBeAg的原材料和溯源選擇上存在一定差異［8］；當2種方法檢測結果發生分歧時，可尋求第三方驗證，本次試驗，由于樣本剩余量不足，未能將所有與CMIA不符的結果進行第三方驗證。總體上，LICA與CMIA在HBV感染的血清學標志項目上符合率很高，而在個別項目上存在一定的差異，但這并不影響本評價試驗得出的結論。總之，LICA以其獨特的檢測技術實現了微量敏感快速均相免清洗檢測，與CMIA相比，具有相近的檢測性能。

參考文獻

［1］王治國.臨床檢驗方法確認與性能驗證［M］.北京：人民衛生出版社，2009：253-255.

［2］Dafforn A，Kirakossian H，Lao K.Miniaturization of the luminescent oxygen channeling immunoassay for use in multiplex array formats and otherbiochips［J］.Clin Chem，2000，46（9）：1495-1497.

［3］Poulsen F，Jensen KB.A luminescent oxygen channeling immunoassay for the determination of insulin in human plasma［J］.J Biomol Screen，2007，12（2）：240-247.

［4］Szekeres PG，Leong K，Day TA，et al.Development of homo-geneous 384-well high-throughput screening assays for Abeta1-40 and Abeta 1-42 using alpha screen technology［J］.Biomol Screen，2008，13（2）：101-111.

［5］馬宏偉，趙衛國，潘柏申.血清肌紅蛋白光激化學發光免疫測定法的建立［J］.檢驗醫學，2006，21（1）：55-57.

［6］高云朝，趙衛國.光激化學發光法檢測甲胎蛋白實驗性能評價［J］.檢驗醫學，2009，24（8）：578-581.

［7］Hou Y，McGuinnees DE，Prongay AJ，et al.Screening for antiviral inhibitors of the HIV integrase-LEDGF/p75 interaction using the alpha screen luminescent proximity assay［J］.J Biomol Screen，2008，13（5）：406-414.

［8］邱春嫦，勞小斌.電化學發光免疫法定量檢測乙肝病毒的臨床應用［J］.中國熱帶醫學，2005，5（4）：678-679.

［2015-08-18收稿，2015-09-16修回］［本文編輯：吳蓉］

［中圖分類號］R512.62

［文獻標志碼］B

［作者單位］266071山東青島，解放軍401醫院檢驗科（王軍，劉妮妮，趙權，葉琳琳，劉婧，劉玉琳，徐菲）

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.02.010