響應(yīng)面法優(yōu)化葫蘆多糖提取條件

阿得力江·吾斯曼 買買提·艾孜子 阿依姑麗·買買提明 吐爾洪·努爾 賽福丁·阿不拉

摘要：【目的】采用響應(yīng)面法優(yōu)化葫蘆多糖提取工藝，為葫蘆多糖的深入研究提供參考依據(jù)。【方法】以葫蘆為原材料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以提取溫度、水料比及提取時間為自變量，采用響應(yīng)面法進(jìn)行3因素3水平的中心組合試驗，分析3個因素及其交互作用對多糖提取率的影響，確定最佳提取工藝條件。【結(jié)果】二次元回歸方程為：Y=

5.54+0.14A+0.43B+0.36C+0.016AB-0.081AC-0.13BC-0.34A2-0.23B2-0.21C2（R2=0.9956；A為提取溫度，B為水料比，C為提取時間，Y為葫蘆多糖提取率）。葫蘆多糖提取率影響因素排序為：水料比>提取時間>提取溫度，3個因素及水料比與提取時間的交互作用對多糖提取率影響極顯著（P<0.01），提取溫度與提取時間的交互作用影響顯著（P<0.05）。葫蘆多糖最佳提取工藝條件為：提取溫度82 ℃、水料比24∶1（mL/g）、提取時間2.3 h、提取次數(shù)2次，在此條件下，多糖提取率可達(dá)（5.810±0.240）%，與模型預(yù)測值5.820%接近。【結(jié)論】通過響應(yīng)面法優(yōu)化的葫蘆多糖提取工藝模型具有可行性，優(yōu)化后的工藝條件可提高葫蘆多糖提取率。

關(guān)鍵詞： 葫蘆；多糖；響應(yīng)面法；提取條件優(yōu)化

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）09-1558-06

Abstract：【Objective】The extraction process of polysaccharides from Lagenaria siceraria（Molina） Standl. were optimized by using response surface methodology， in order to provide technical support for further study of polysaccharides from L. siceraria. 【Method】With L. siceraria as raw materials， based on single factor experiment， the extraction temperature， liquid-solid ratio and extraction time were selected as independent variables. Response surface methodology based on a central composite design with 3 factors and 4 levels was applied to analyze effects of 3 factors and their interactions on extraction rate of polysaccharides， so as to optimize extraction conditions. 【Result】The results showed that， the quadratic multinomial regression equation was established as：Y=5.54+0.14A+0.43B+0.36C+0.016AB-0.081AC-0.13BC-

0.34A2-0.23B2-0.21C2（R2=0.9956； A： extraction temperature； B： liquid-solid ratio； C： extraction time）. The 3 factors affecting extraction rate was in order as follows： liquid-solid ratio>extraction time>extraction temperature. Three factors and interaction between liquid-solid ratio and extraction time had extremely significant effect on extraction rate of polysaccharides（P<0.01）， and the interaction between extraction temperature and extraction time also had significant effect（P<0.05）. The optimum extraction process was as follows： extraction temperature of 83 ℃， liquid-solid ratio ratios of 24∶1（mL/g）， extraction time of 2.3 h， extracting polysaccharides twice. Under optimum condition， the extraction rate of polysaccharides was up to （5.810±0.240）%， which was close to the theoretical value（5.820%）. 【Conclusion】The response surface methodology is workable to optimize extraction process of polysaccharides， the optimized process conditions can improve extraction rate of polysaccharides from L. siceraria.

Key words： Lagenaria siceraria（Molina） Standl.； polysaccharide； response surface methodology； optimization of extraction condition

0 引言

【研究意義】葫蘆[Lagenaria siceraria（Molina） Standl.]是新疆及周邊地區(qū)常見的一種食用植物，也是一種傳統(tǒng)中藥（Shah et al.，2010；阿不都熱依木·卡地爾·阿塔哥，2012）。中醫(yī)記載葫蘆可用于治療水腫、小便不利、黃疸等癥（邱德文等，2007），維吾爾醫(yī)藥學(xué)中葫蘆常用于清熱消炎、解郁除狂、潤腸通便、安神催眠等（宋立人和胡烈，2005）。在印度等國家，葫蘆是一種常見補(bǔ)品，同時也作為驅(qū)蟲、強(qiáng)心、降血脂、壯陽、瀉藥、利尿等藥物使用（Rahman，2003；Ahmad et al.，2011）。報道顯示，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、保肝等多種作用（劉姚等，2013）。因此，優(yōu)化葫蘆多糖提取工藝，對其藥理作用的進(jìn)一步研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】已有研究表明，葫蘆含糖類、黃酮、生物堿、葫蘆素、類固醇、皂苷、多酚等多種化合物（Ghosh et al.，2008；Irshad et al.，2010），其中糖類含有甲基-D-半乳糖、2-O-甲基-D-木糖、D-木糖、葡萄糖和果糖等成分（Calabrese et al.，1999；Ghosh et al.，2008），但目前有關(guān)葫蘆有效成分提取工藝的研究較少。范宏等（2013）采用超聲波輔助提取甜葫蘆中葫蘆素B，在最佳提取工藝條件（料液比1∶10、甲醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時間15 min、超聲波功率500 W）下得到葫蘆素B提取率0.799%；阿力木江·阿不力孜（2014）采用水提醇沉法提取葫蘆多糖，并通過正交試驗優(yōu)化其提取工藝，得到最佳提取工藝條件為：提取溫度90 ℃、水料比25∶1、提取時間120 min，在此條件下多糖提取率為5.41%。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆多糖能提高小鼠血清中IL-2水平，同時降低血清中TGF-β1含量，從而發(fā)揮對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用（阿力木江·阿不力孜等，2015）。【本研究切入點】目前采用響應(yīng)面法優(yōu)化葫蘆多糖提取工藝的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】選擇提取溫度、水料比和提取時間為影響因素，采用響應(yīng)面法確定葫蘆多糖最佳提取工藝，為葫蘆多糖的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

葫蘆采自新疆喀什地區(qū)，干燥后粉碎過60目篩密封備用。主要試劑：重蒸酚（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、無水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、葡萄糖（天津永晟精細(xì)化工有限公司）。主要儀器設(shè)備：ZN-08小型粉碎機(jī)（北京興時利和科技發(fā)展有限公司）、HH-W420數(shù)顯三用恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、ME204E型電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]、TDL-50型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 葫蘆多糖提取流程 葫蘆→干燥→粉碎過60目篩→95%乙醇回流脫脂→水煮過濾，取上清液→減壓濃縮→加無水乙醇至80%醇沉→4 ℃沉淀24 h，取沉淀→干燥的粗多糖。

1. 2. 2 多糖含量測定 采用苯酚—硫酸法測定葫蘆多糖含量（陳乃東等，2013）。取300 g干燥葫蘆，粉碎過60目篩，用95%無水乙醇回流3次進(jìn)行脫脂，每次1.5 h，30 ℃烘干備用。取備用的葫蘆粉末1.00 g置于150 mL圓底燒瓶中，按照1.2.1步驟進(jìn)行提取，經(jīng)4000 r/min離心10 min后收集沉淀，烘干稱重并測定吸光值，計算葫蘆多糖含量，再根據(jù)下式計算提取率：

多糖提取率（%）=多糖提取量/原料干重×100

1. 2. 3 單因素試驗 分別以提取次數(shù)（1、2、3、4和5次）、提取溫度（60、70、80、90和100 ℃）、水料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1（mL/g）]和提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h）為單因素，每個測試組重復(fù)4次取平均值，并做顯著性分析，考察不同因素對葫蘆多糖提取率的影響。

1. 2. 4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 綜合單因素試驗所得的結(jié)果，提取2次后對葫蘆多糖提取率無顯著影響，故選擇提取溫度、水料比、提取時間3個因素，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析，設(shè)計因素水平見表1。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0對單因素試驗結(jié)果進(jìn)行處理和分析，Design Expert 8.0.6對響應(yīng)面試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1 提取次數(shù)對葫蘆多糖提取率的影響 由圖1可知，固定提取溫度80 ℃、水料比20∶1、提取時間2.0 h的條件下，提取2次的葫蘆多糖提取率顯著高于提取1次（P<0.05，下同），提取次數(shù)超過2次后，多糖提取率基本趨于穩(wěn)定，無顯著變化（P>0.05，下同）。因此，提取次數(shù)為2次較合適。

2. 1. 2 提取溫度對葫蘆多糖提取率的影響 由圖2可知，固定水料比20∶1、提取時間2.0 h、提取次數(shù)2次的條件下，在提取溫度60～80 ℃范圍內(nèi)，葫蘆多糖提取率顯著升高，80 ℃達(dá)最大值，80 ℃后多糖提取率有所下降。因此，提取溫度選擇80 ℃左右為宜。

2. 1. 3 水料比對葫蘆多糖提取率的影響 由圖3可知，固定提取溫度80 ℃、提取時間2.0 h、提取次數(shù)2次的條件下，水料比為10∶1～20∶1時，葫蘆多糖提取率快速升高，在20∶1～30∶1范圍內(nèi)提取率趨于平穩(wěn)。從優(yōu)化工藝的角度綜合考慮，選擇水料比在20∶1左右較合適。

2. 1. 4 提取時間對葫蘆多糖提取率的影響 由圖4可知，固定提取溫度80 ℃、水料比20∶1、提取次數(shù)2次的條件下，提取時間在0.5～2.0 h范圍內(nèi)，葫蘆多糖提取率顯著升高，2.0 h后多糖提取率升高相對緩慢，無顯著變化。綜合考慮，提取時間控制在2.0 h左右為宜。

2. 2 響應(yīng)面法優(yōu)化葫蘆多糖提取工藝

2. 2. 1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 利用Design Expert 8.0.6對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次元回歸擬合，以提取溫度（A）、水料比（B）、提取時間（C）為自變量，得回歸方程為：Y=5.54+0.14A+0.43B+0.36C+0.016AB-0.081AC-0.13BC-0.34A2-0.23B2-0.21C2。對回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。回歸模型P<0.0001，失擬項P=0.2263>0.05（不顯著），相關(guān)系數(shù)R2=0.9956，AdjR2=0.9900，均接近1.0000，且變異系數(shù)CV=0.94%，說明該模型擬合度好，適用于實際提取工藝。葫蘆多糖的最佳提取工藝為：提取溫度81.47 ℃、水料比23.89∶1、提取時間2.28 h、提取次數(shù)2次，此條件下預(yù)測的提取率為5.820%。

2. 2. 2 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)響應(yīng)圖等高線形狀及3D圖中因素的趨勢，可判定變量間相互作用是否明顯，各因素對葫蘆多糖提取率影響的程度，確定各因素的最佳水平范圍。如圖5所示，隨著水料比的增大，多糖提取率不斷增加，對于提取溫度則有一個閾值在80～85 ℃，超出此閾值，溫度升高提取率則降低，水料比對多糖提取率的影響大于提取溫度。圖6中，隨著提取時間的延長，多糖提取率不斷增加，提取溫度的變化與圖5一致，在80～85 ℃有一個閾值，提取時間對多糖提取率的影響大于提取溫度。圖7中，隨著水料比的增大和提取時間的延長，多糖提取率增加。結(jié)合圖5～圖7及表3可知，各因素對葫蘆多糖提取率的影響排序為：水料比（B）>提取時間（C）>提取溫度（A），3個因素及水料比與提取時間的交互作用對多糖提取率影響極顯著（P<0.01，下同），提取溫度與提取時間的交互作用影響顯著。

2. 2. 3 試驗結(jié)果驗證 為驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可信度，將優(yōu)化參數(shù)修正為：提取溫度82 ℃、水料比24∶1、提取時間2.3 h，提取次數(shù)2次，在此條件下進(jìn)行4次平行試驗，得到葫蘆多糖提取率為（5.810±0.240）%，與預(yù)測的提取率5.820%接近，說明以上優(yōu)化條件可行。

3 討論

植物多糖的提取方法主要有溶劑提取法、酶提取法、微波提取法、超臨界萃取法等。其中溶劑提取法是傳統(tǒng)提取方法，該方法提取成本低廉、操作簡單、適用于大規(guī)模生產(chǎn)；酶提取法是利用一種或多種特定的酶對植物細(xì)胞壁進(jìn)行破解，使內(nèi)容物完全釋放的一種較溫和的多糖提取方法（屈小玄等，2015），但該法對酶的要求較高，特定酶在未知情況下難以實現(xiàn)多糖的提取；微波提取法是利用微波在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化（馬濤等，2011），該方法提取時間短，但提取過程中可能會破壞多糖結(jié)構(gòu)；超臨界萃取法提取時間短、無溶劑殘留，但該方法對設(shè)備要求高，且由于糖類化合物分子量較大、極性強(qiáng)，以CO2為溶劑的提取率低（黃小葳，2011）。目前國內(nèi)對葫蘆多糖提取工藝的研究鮮有報道。本研究采用響應(yīng)面法對葫蘆多糖的溶劑提取法進(jìn)行優(yōu)化，因溶劑提取為常用的傳統(tǒng)方法之一，成本低且不需特殊設(shè)備，是初步探究提取工藝最常用的方法之一。與正交試驗相比，利用響應(yīng)面法優(yōu)化葫蘆多糖的提取工藝，既能確定各因素間的相互作用，又能通過模型預(yù)測值和驗證性試驗來確保結(jié)果的可靠性，達(dá)到提高多糖提取率的目的。

本研究確定了各因素對葫蘆多糖提取率影響的大小及各因素間的交互作用，各因素影響排序為：水料比>提取時間>提取溫度，3個因素及水料比與提取時間的交互作用對多糖提取率的影響極顯著，提取溫度與提取時間的交互作用影響顯著，而提取溫度與水料比的交互作用影響不顯著。本研究的葫蘆多糖最佳提取溫度（82 ℃）較阿力木江·阿不力孜（2014）試驗所得的提取溫度（90 ℃）低，提取時間和水料比基本一致；3個因素中提取溫度對多糖提取率的影響最小，且在適當(dāng)范圍內(nèi)提取溫度低，有利于防止因高溫引起的多糖活性降低或化學(xué)結(jié)構(gòu)改變。在優(yōu)化條件下通過驗證試驗得到葫蘆多糖提取率為（5.810±0.240）%，與預(yù)測的提取率5.820%接近，較阿力木江·阿不力孜（2014）正交試驗測得的葫蘆多糖提取率（5.41%）略高，說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化葫蘆多糖提取工藝可提高其提取率。

目前對葫蘆多糖的研究仍處于初步階段，葫蘆多糖分子量測定、單體的分離及結(jié)構(gòu)鑒定，藥理作用如抗炎、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等方面有待進(jìn)一步研究，本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化葫蘆多糖的提取工藝可為其相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化的葫蘆多糖提取工藝模型具有可行性，優(yōu)化后的工藝條件可提高葫蘆多糖提取率。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）