HPLC法測(cè)定坐珠達(dá)西中西紅花苷的含量

馬宏偉 孫緒丁 田汝芳

【摘要】目的：建立測(cè)定坐珠達(dá)西中西紅花含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.05mol/L醋酸銨（40∶5∶55），檢測(cè)波長為440nm；流速為1ml/min；柱溫為30℃。結(jié)果：西紅花苷Ⅰ的質(zhì)量濃度在6.208μg/ml～62.08μg/ml范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r=0.9997）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD<2%；平均加樣回收率為98.31%，RSD=0.86%（n=6）；西紅花苷Ⅱ的質(zhì)量濃度在3.072～30.72μg/ml范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r=0.9999）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD<2%；平均加樣回收率為97.69%，RSD=0.99%（n=6）。結(jié)論：該方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于坐珠達(dá)西中西紅花苷的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】坐珠達(dá)西；西紅花苷Ⅰ；西紅花苷Ⅱ；高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）07-0015-02

Abstract：Objective To develop a method for the content determination of croci stigma in zuozhudaxi.Methods HPLC method was adopted.The determination was performed on Waters C18 column （250mm×4.6mm， 5μm） with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-0.05mol/L ammonium acetate （40∶5∶55） at the flow rate of 1ml/min. The detection wavelength was set at 440 nm， and column temperature was 30 ℃.Results The linear range of crocin Ⅰ were 6.208～62.08μg/ml（r=0.9997） with an average recovery of 98.31% （RSD=0.86%，n=6）；RSDs of precision， stability and reproducibility tests weve all lower than 2%. The linear range of crocin Ⅱ were 3.072～30.72μg/ml（r=0.9999） with an average recovery of 97.69% （RSD=0.99%，n=6）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests weve all lower than 2%.Conclusion The method is simple，accurate，and can be used for the content determination of croci stigma in zuozhudaxi.

Keywords：zuozhudaxi；crocin Ⅰ；crocin Ⅱ；HPLC

坐珠達(dá)西由寒水石、丁香、西紅花、肉豆蔻等35味藥材組成[1]，是藏醫(yī)治療慢性胃炎的常用藥物[2]。坐珠達(dá)西中的西紅花又稱藏紅花，為鳶尾科植物番紅花Crocus sativus L.的干燥柱頭[3]，為貴重藥材，其主要有效成分為西紅花酸和西紅花苷，藥典以西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的含量來控制西紅花的質(zhì)量。現(xiàn)有測(cè)定西紅花中西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的方法較多，但均不適用于成分復(fù)雜的藏藥制劑坐珠達(dá)西[4-9]。為此，建立坐珠達(dá)西中西紅花苷的含量測(cè)定方法，為該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日立L-7110泵，日立L-7420紫外檢測(cè)器）；KQ-300B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW220D型電子天平（日本）。

1.2 材料 西紅花苷Ⅰ（批號(hào)：111588-201303）、西紅花苷Ⅱ（批號(hào)：111589-201304）購自中國食品藥品檢驗(yàn)研究院；坐珠達(dá)西（批號(hào)：20140501、20140502、20140503金訶藏藥股份有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純（美國fisher公司），水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Waters C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.05mol/L醋酸銨（40∶5∶55）；檢測(cè)波長：440nm；流速：1ml/min；柱溫：30℃。理論板數(shù)按紅花苷Ⅰ峰計(jì)算應(yīng)不低于3500。見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取西紅花苷Ⅰ對(duì)照品約15mg，精密稱定為15.52mg，置10ml量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.552mg/ml的西紅花苷Ⅰ對(duì)照品溶液；取西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌芳s7.5mg，精密稱定為7.68mg，置10ml量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.768mg/ml的西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤海痪芰咳∩鲜鑫骷t花苷Ⅰ對(duì)照品溶液和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤焊?ml，置同一50ml量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得含西紅花苷Ⅰ為31.04μg/ml，含的西紅花苷Ⅱ?yàn)?5.36μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取坐珠達(dá)西樣品，研細(xì)，過3號(hào)篩，取粉末1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25ml，稱定重量，冰浴中超聲處理20min，放至室溫，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下西紅花苷Ⅰ對(duì)照品溶液和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤焊?ml，置于50ml量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得含西紅花苷Ⅰ為62.08μg/ml，含西紅花苷Ⅱ?yàn)?0.72μg/ml的混合對(duì)照品溶液，分別精密量取上述混合對(duì)照品溶液1、3、5、8，10ml，置10ml量瓶中，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量10μl，記錄色譜峰峰面積。以西紅花苷Ⅰ峰面積（A）對(duì)對(duì)照品濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=22532.96C-1266.18（r=0.9997）；以西紅花苷Ⅱ峰面積（A）對(duì)對(duì)照品濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=27149.44C+1868.11（r=0.9999）。結(jié)果表明，西紅花苷Ⅰ在6.208～62.08μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，西紅花苷Ⅱ在3.072～30.72μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μl，記錄峰面積。結(jié)果，西紅花苷Ⅰ峰面積的RSD為0.15%（n=6），結(jié)果，西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD為0.90%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8h進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量10μl，記錄峰面積。結(jié)果，西紅花苷Ⅰ峰面積的RSD為0.14%（n=6），結(jié)果，西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD為0.19%（n=6），表明供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果，西紅花苷Ⅰ峰面積的RSD為0.46%（n=6），西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD為1.00%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品0.5g，共6份，分別加入一定體積的對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1和表2。

2.8 樣品含量測(cè)定 取三個(gè)批號(hào)的樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討論

坐珠達(dá)西收載于衛(wèi)生部藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)中，原標(biāo)準(zhǔn)沒有含量測(cè)定項(xiàng)。藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)并未公布坐珠達(dá)西的全部處方，在已知原藥材中，西紅花是貴重藥材，應(yīng)當(dāng)建立含量測(cè)定方法。但由于該產(chǎn)品由35味藥材組成，成分復(fù)雜，現(xiàn)有關(guān)于西紅花中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量測(cè)定方法并不適用，或保留時(shí)間長，或分離度差。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，建立了本文所述方法，可以同時(shí)測(cè)定西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ，保留時(shí)間適中，分離度好，操作簡單，可用于坐珠達(dá)西中西紅花的含量測(cè)定。

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（收稿日期：2016.01.29）