一株乳酸片球菌P—24的高密度發酵

石娜娜　王波　王玉芳　高坤

摘 要 由單因素和正交實驗優化得到了P-24菌株的高密度發酵培養基配方（g/L）：蔗糖25，檸檬酸鈉3，乙酸鈉2，酵母粉8，蛋白胨5，玉米漿20，MgSO4*7H2O 0.4，K2HPO4 1.0，pH值6.2～6.6。通過3 L發酵罐小試，發酵過程中進行pH的調節和補糖，使乳酸片球菌P-24的生物量提高了9倍，有效活菌數達9×1010 CFU/mL。

關鍵詞 乳酸片球菌；生物量；培養基優化

中圖分類號：TQ920.6 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）01--02

乳酸片球菌乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，P.a）是一種動物體內的益生菌，是一種常見的乳酸菌。可直接應用于動物飼料、動物喂食和青貯飼料中。在飼料中能抑制腐敗微生物的生長，解決飼料腐敗問題，提高飼料適口性和消化率[1]。乳酸片球菌在香腸發酵中具有較高的競爭性和環境適應性[2]。其在肉制品發酵中產酸，使pH下降，賦予其特有的風味。另外，乳酸片球菌產生的各種酶類物質，可使肉中的蛋白質分解為人體易吸收的物質，提高其產品的營養價值。

目前，對乳酸片球菌的研究主要集中在生產應用領域，但對發酵工藝方面的研究卻很少，大部分用傳統MRS培養基進行發酵，但它的成本高，活菌數少，本實驗對P-24的培養基進行了優化，降低了生產成本，有效提高了活菌數。

1 材料和方法

1.1 菌種

乳酸片球菌C1C-1241，濰坊工程職業學院生化學院保藏菌種。

1.2 培養基

出發培養基為MRS培養基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母粉5、檸檬酸氫二銨2、乙酸鈉5、磷酸氫二鉀2、硫酸鎂0.58、硫酸錳0.25。

1.3 生物量的檢測

在600 nm處對菌體溶液進行比色，根據濁度判定生物量。

1.4 單因素優化

將MRS培養基中的葡萄糖，替換為蔗糖、麥芽糖、乳糖及液化淀粉；檸檬酸氫二銨替換為檸檬酸鈉；蛋白胨+酵母粉替換為酵母粉、蛋白胨、玉米漿、蛋白胨+酵母粉、酵母粉+玉米漿、酵母粉+蛋白胨+玉米漿，確定最佳碳源和氮源。

向MRS培養基中添加不同濃度的硫酸鎂、磷酸氫二鉀和硫酸錳，確定最佳無機鹽種類和濃度。

1.5 正交優化試驗

在單因素實驗的基礎上，選擇蔗糖、蛋白胨、檸檬酸鈉設計三因素三水平正交實驗，優化發酵培養基的配方。見表1。

1.6 3 L發酵罐初始試驗

用優化后的培養基在3 L發酵罐中初試，發酵過程中用8 mol/L的NaOH控制發酵液pH在5.5～6.5。

2 結果與討論

2.1 單因素優化結果

2.1.1 最佳碳源、氮源

以蔗糖為碳源時，OD600為4.043，選擇蔗糖作為最佳碳源。以酵母粉+蛋白胨+玉米漿為氮源時OD600值3.281，與蛋白胨+酵母粉相差無異，但考慮到生產成本，選擇酵母粉+蛋白胨+玉米漿作為氮源。

檸檬酸氫二銨成本較高，為降低成本，用等量的檸檬酸鈉將其代替，通過生物量的比較發現，能提高其生物量OD600為3.521。

2.1.2 最佳無機鹽種類及濃度

添加0.4 g/L的Mg2+時發酵液的生物量最大，OD600為3.500；添加1g/L的K2HPO4時發酵液的生物量最大，OD600為3.728；Mn2+不利P-24的發酵，不添加。

2.2 正交優化試驗結果

根據上述單因素實驗結果，進行蔗糖、檸檬酸鈉和蛋白胨三因素正交實驗，各因素影響順序為蛋白胨>檸檬酸鈉>蔗糖，最優組合為A2B3C1。可得到優化的發酵培養基為（g/L）：蔗糖25，檸檬酸鈉3，乙酸鈉2，蛋白胨5，酵母粉5，玉米漿12，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.4，此配方下生物量OD600為4.700。

2.3 3 L發酵罐初試及結果

將優化后培養基在3 L發酵罐上初試，6 h后通過級聯控制滴加NaOH，使pH在5.5～6.0以及6.0～6.5范圍內波動，直至發酵結束，選擇最適pH范圍。

從圖1可以看出，該菌pH從0～8 h一直在下降，而控制發酵液pH可以提高菌體生物量。當pH在5.5～6.0時，更適合菌體的生長，此時OD600為11.820，有效活菌數為6.8×1010 CFU/mL。

在發酵培養至8h時開始補料，向發酵罐中一次補入10 mL葡萄糖溶液，之后每隔2 h進行一次補料，共補料3次，發酵至25 h結束，此時P-24有效活菌數為90億/mL，菌體OD600為13.5～14.0。

3 結論

乳酸片球菌在動物飼料、青貯飼料、食品等方面均有重要的應用價值，采用優化后的發酵培養基并再發酵過程中控制pH，提高了乳酸片球菌的菌體量，優化后的培養基配方及發酵方法對其生物菌劑的生產提供了重要參考。

參考文獻

[1]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業出版社，1999.

[2]楊華.發酵劑及抗氧化劑對鯰魚發酵香腸品質的影響[J].食品與發酵工業，2010（9）.

（責任編輯：趙中正）