微衛星DNA標記應用前景淺議

馮欽

摘 要 微衛星廣泛存在于真核生物基因組中，一般由1～6個堿基組成重復片段，因為其種類多、分布廣及重復次數在個體間具有高度的變異性呈現高度的多態性、共顯性，所以微衛星DNA標記已經成為種群遺傳學中被廣泛應用的分子標記。就微衛星的結構、功能及其形成機制方面在特定基因定位，種群遺傳結構分析、種群內親緣關系界定、物種進化分析等方面的應用進行闡述。

關鍵詞 微衛星；物種進化；基因圖譜；親子鑒定

中圖分類號：S852.2 文獻標志碼：B 文章編號：1673-890X（2016）01--02

分子標記是以個體之間的遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平上遺傳多態性的直接的反映。微衛星標記是繼RFLP、AFLP之后的一種新的遺傳標記。微衛星標記已被廣泛應用于保護遺傳學研究的各個領域，包括種群遺傳多樣性評估、種群遺傳結構分析、遺傳圖譜構建、基因定位和親子鑒定等。

1 微衛星標記的發現

20世紀70年代，生物科學家Litt[1]等在研究寄居蟹基因組DNA時發現其基因組中存在許多不同堿基的重復序列。在后續研究中，發現人、動物和酵母基因組中均存在大量類似的重復單元并于1988年將此重復序列作為新的遺傳標記并應用于人類，創造出“微衛星”（Microsatellite）的名稱。

2 微衛星的結構

微衛星又稱簡單重復系列（Simple Sequence Repeats，SSR）或簡單串聯重復序列多態性（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP），這些位點由短的重復串聯序列（1～6 bp）組成。這些微衛星序列廣泛分布于基因組中，其重復次數以及重復程度在不同生物及個體之間呈現高度多態性。依據微衛星核心序列的排列方式將微衛星分為3大類，完全重復（無間隔），不完全重復（間隔序列存在于重復單元中）和復合型（2個以上重復單元）。

3 微衛星的篩選

目前，獲得微衛星DNA的方法有3種。一是通過構建基因組文庫，標記核心重復序列作為探針，與基因組文庫進行雜交篩選，然后測序進而設計特異性引物等步驟；二是利用近緣物種DNA序列的同源關系，通過已知的微衛星引物跨種使用，進而篩選到適合新物種的微衛星DNA標記；三是利用高通量測序，構建文庫，利用生物信息學知識進行大面積篩選。目前，隨著基因組計劃的全面展開，三大DNA數據庫Genebank、EMBL、DDJB收錄的數據越來越多，通過檢索比對將更容易獲取更多的微衛星標記。

4 微衛星的特點

微衛星DNA遵循孟德爾遺傳，呈共顯性，在基因組中分布廣、多態性高，實驗操作簡單，結果穩定可靠等優點，有效克服了RAPD、AFLP等標記的隨機性，即不同位點但大小相同的等位基因，所以微衛星成為分析生物群體遺傳結構與變異的理想分子標記。微衛星呈現多態性，主要體現在其核心序列的重復數的多態性以及等位基因位點的多態性。研究結果表明，微衛星重復單元重復次數越多，其等位基因的數目也越多。微衛星的突變率較高，在不同物種及個體之間的相同位點的不同等位基因和不同位點之間均存在較大的多態性。

微衛星DNA標記符合孟德爾遺傳，遺傳信息從上一代傳遞到下一代，并呈共顯性，每個位點存在多個等位基因且具備較高的多態性，降低了自然選擇對其的影響，且其結果穩定可靠。一系列不同微衛星位點的等位基因數據，可以顯示遺傳重組事件和基因型關系，進而推算種群間的遺傳交流。因此，微衛星DNA標記被廣泛應用于物種進化和種群結構等方面。

5 微衛星的應用

5.1 群體遺傳結構分析

微衛星呈現共顯性，屬于單位點遺傳標記。每個微衛星位點存在多個等位基因，具有較高的雜合度，對于自然選擇的影響較小，因此微衛星標記非常適合研究種群變異。England[2]等利用8個微衛星位點對黑尾果蠅群體進行檢測，發現微衛星比同工酶具有更高的多態性。Machugh[3]等利用25個微衛星位點對39個不同品系的歐洲牛進行分析，計算其個體之間的遺傳距離并構建遺傳圖譜，圖譜顯示與已知的遺傳背景接近。微衛星NA標記，基于其位點的不同等位基因及雜合性，在分析種群間的遺傳結構都表現了高度的有效性。

5.2 物種進化和系統發生

微衛星的多態性可以反映物種的進化歷程，物種的分化速度及遺傳距離，基于此推斷物種的系統進化與演變。Estoup[4]等利用7個微衛星引物對7個西方蜜蜂群（3個非洲、4個歐洲）進行分析，表明西方蜜蜂是由3個親緣較遠的蜜蜂群進化而來。而Franck[5]則利用8微衛星位點分析埃及蜜蜂，表明埃及蜜蜂來源于西方蜜蜂，進一步研究意大利和西西里蜜蜂之間的遺傳差異，從而闡明了兩者的起源與進化。

5.3 遺傳多樣性與物種資源保護

物種滅絕消失，其遺傳信息也將隨之而去，導致自然界的遺傳多樣性降低。因此，遺傳多樣性與保護已經成為生物多樣性研究的主要內容。微衛星成多態性，統計不同位點的等位基因數目和頻率，進而分析物種種群的遺傳結構，評估其遺傳多樣性；同時，計算不同品種之間的遺傳變異關系。選擇有效基因，并對有效基因在世代過程中的傳遞進行跟蹤，有意識的進行選種，防止有效基因因為遺傳票變而丟失，進而提出可靠合理的遺傳保護措施[6]。目前，針對瀕危野生動物，應當建立個體遺傳檔案，有意識的制定繁殖進化，防止近親交配，導致物種衰退。

5.4 親緣關系鑒定

微衛星位點多態性高，每個位點存在多個等位基因，并且遵循孟德爾遺傳規律，呈顯性，遺傳信息穩定的進行世代傳遞。微衛星在個體之間具有高度的個體專一性和多態性，基于以多個位點在一定的群體中計算等位基因的頻率從而推斷血緣鑒定。目前，隨著對動物個體及其品質的要求越來越高，明確的譜系在育種過程中是非常必要的。大熊貓屬于一雌多雄的生殖方式，利用微衛星張亞平等成功的對其家系進行了驗證[7]。

6 微衛星的相關問題

目前，微衛星標記被廣泛應用于生物種群遺傳學、種群生態學、親子鑒定等領域，但是該技術也受到一些其他方面因素的制約。一是微衛星的篩選，檢測及鑒定；二是對于非損傷性獲取樣品進行檢測也存在一定的困難；三是PCR引物在不同物種間的保守性不高，需要針對不同物種設計特異性引物；四是引物擴增可能出現無效等位基因，導致結果無法使用。同時，仍有很多有關微衛星的研究尚在探索中，如微衛星的功能、三堿基重復序列的不穩定性的分子機理，以及微衛星突變導致的疾病機理。

參考文獻

[1]Litt M ， Luty J A. A Hypervariable Microsatellite Revealed by In Vitro Amplification of A Dinucleotide Repeat within the Cardiac Muscle Actin Gene[J].American Journal of Human Genetics，1989，44（3）.

[2] England P R， Briscoe D R. Microsatellite pPolymorphisms in aA wWild pPopulation of Drosophila mMelanogaster.[J]. Genetics Research， 1996， 67（3）：285-290.

[3] Machugh D E， Shriver M D， Loftus R T， et al. Microsatellite DNA vVariation and the eEvolution， dDomestication and pPhylogeography of tTaurine and zZebu cCattle （Bos taurus and Bos indicus）.[J]. Genetics， 1997， 146（3）：1071-1086.

[4] Estoup A， Garnery L. Microsatellite vVariation in hHoney bBee （Apis mellifera l.） pPopulations： Hierarchical genetic[J]. Genetics， 1995（7）.

[5] Franck P， Garnery L， Solignac M， et al. Molecular cConfirmation of aA fFourth lLineage in hHoney bBees from the Near East[J]. Apidologie， 2000， 31（2）：167-180.

[6]黃磊，王義權.微衛星分子標記在瀕危動物保護遺傳學研究中的應用[J].生物多樣性，2004（5）.

[7]高煥，孔杰，于飛，等.人工控制自然交尾條件下中國對蝦父本的微衛星識別[J].海洋水產研究，2007，28（1）.

（責任編輯：趙中正）