MK571對膿毒癥大鼠急性肺損傷的影響

蘇　鑌,夏文芳,周青山,鄭顏磊

(武漢大學人民醫院， 湖北 武漢 430060)

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論著

MK571對膿毒癥大鼠急性肺損傷的影響

蘇鑌,夏文芳,周青山,鄭顏磊

(武漢大學人民醫院， 湖北 武漢 430060)

[摘要]目的觀察MK571對膿毒癥大鼠急性肺損傷的影響。方法將45只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、膿毒癥組和MK571干預組，每組15只。膿毒癥組和MK571干預組采用盲腸結扎穿刺法制作膿毒癥模型。MK571干預組術前30 min腹腔注射MK571 25 mg/kg。術后12 h和24 h采靜脈血分別檢測血清白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。術后24 h行支氣管肺泡灌洗，留取灌洗液行白細胞計數，并留取肺組織做病理學觀察評估肺組織損傷程度。結果膿毒癥組大鼠術后血清IL-1β和TNF-α水平及支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數均顯著高于假手術組(P均<0.05)，肺組織損傷明顯。MK571干預組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平及支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數均明顯低于膿毒癥組(P均<0.05)，肺組織損傷明顯減輕。結論MK571可有效減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷。

[關鍵詞]膿毒癥；肺損傷；炎癥；MK571；大鼠

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征，是非心血管重癥監護病房中病死率最高的疾病。肺臟是眾多器官當中最常且最早受累的，隨之而來的急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征會顯著延長患者住院時間，增加病死率[1]。目前認為，炎癥級聯反應是膿毒癥肺損傷的核心機制之一[2]。MK571是半胱氨酰白三烯受體1(CysLTR1)拮抗劑，具有抑制炎癥反應的作用[3]。研究發現，MK571可減輕機械通氣誘導的急性肺損傷[4]。本研究利用盲腸結扎穿刺法建立大鼠膿毒癥動物模型，觀察MK571對膿毒癥大鼠急性肺損傷的影響。

1實驗資料

1.1實驗動物選用SPF級雄性SD大鼠，體質量230～280 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證編號：11401300010595。實驗前由武漢大學人民醫院實驗動物中心適應性飼養1周，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h光暗周期，自由飲水及進食。實驗過程嚴格按照動物實驗實施及管理辦法執行。

1.2實驗方法將45只SD雄性大鼠隨機分為假手術組、膿毒癥組和MK571干預組，每組15只。假手術組大鼠僅接受盲腸探查術，不結扎及穿刺。膿毒癥組和MK571干預組均采用盲腸結扎穿刺法制作膿毒癥模型：1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)腹腔麻醉，剔除腹部局部毛發，消毒，沿腹正中線做2 cm切口，暴露盲腸，將糞便輕輕擠向盲腸盲端，絲線結扎盲腸2/3長度，用20G針頭由系膜端向對側穿通盲腸2次，于盲腸尖端穿刺1次，共5孔，避開血管，并擠出適量糞便，將盲腸放回腹腔，逐層縫合切口，術畢于皮下注射林格氏液3 mL/100 g，補充手術過程中體液的丟失及術后一段時間的需要量，以提高實驗大鼠的生存率。MK571干預組大鼠行盲腸結扎穿刺術前30 min腹腔注射MK571 20 mg/kg。假手術組及膿毒癥組術前30 min注射等容量生理鹽水。

1.3檢測項目

1.3.1細胞因子檢測于術后12 h及24 h各抽取大鼠尾靜脈血1 mL靜置15 min，1 200 r/min、4 ℃離心20 min，采集血清，-20 ℃保存。用酶聯免疫吸附(ELISA)法試劑盒檢測術后12 h時白細胞介素-1β(IL-1β)水平和術后24 h時腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(深圳欣博盛生物科技有限公司)水平，檢測方法按照試劑盒說明書進行。

1.3.2支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數于術后24 h麻醉大鼠后開胸，氣管切開后行左主支氣管插管，套線結扎于主氣管上防止灌洗液漏出及氣管導管脫出，鉗閉右主支氣管并留取右下肺行病理檢查。行左支氣管肺泡灌洗，每次4 mL生理鹽水共5次，回收率大于75%為合格，收集灌洗液，1 500 r/min、4 ℃離心10 min，離心后吸去上清液，沉淀所得細胞團用0.3 mL生理鹽水懸浮，行白細胞計數，采用牛鮑氏板雙人雙盲計數，取平均值。

1.3.3肺組織病理學檢查各組大鼠于術后24 h麻醉后取右肺下葉，多聚甲醛固定，常規石蠟切片(5 μm)，行蘇木精-伊紅(HE)染色，普通光鏡下(×200)觀察肺組織的充血、水腫、損傷及炎癥細胞浸潤情況。

1.4統計學方法采用SPSS19軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.13組肺組織病理檢查表現 假手術組大鼠肺組織結構較完整，肺間質無水腫，肺泡腔內無明顯液體及細胞滲出，見圖1。膿毒癥組大鼠肺間質見大量炎性細胞浸潤，肺泡結構破壞明顯，肺泡隔增寬，肺泡腔可見廣泛出血，毛細血管擴張，見圖2。MK571干預組大鼠較膿毒癥組大鼠肺組織炎癥細胞浸潤減少，肺泡隔增寬程度不及膿毒癥組明顯，出血明顯減少，結構也較膿毒癥組完整，見圖3。

2.23組血清IL-1β、TNF-α含量比較膿毒癥組大鼠術后12 h血清IL-1β水平和術后24 h血清TNF-α水平均顯著高于假手術組(P均<0.05)，MK571干預組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平均明顯低于膿毒癥組(P均<0.05)。見表1。

圖1　假手術組大鼠肺組織病理切片HE染色表現(×200)

圖2　膿毒癥組大鼠肺組織病理切片HE染色表現(×200)

圖3　MK571干預組大鼠肺組織病理切片HE染色表現(×200)

組別IL-1βTNF-α假手術組138.16±30.7721.58±3.82膿毒癥組793.57±184.56①105.49±26.42①MK571干預組546.65±195.31①②77.69±22.59①②

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與膿毒癥組比較，P<0.05。

2.33組支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數比較假手術組、膿毒癥組、MK571干預組支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數分別為(16.5±15.8)104L-1、(107.4±53.4)104L-1、(65.8±24.8)104L-1，膿毒癥組白細胞計數顯著高于假手術組(P<0.05)，而MK571干預組明顯低于膿毒癥組(P<0.05)。

3討論

隨著對膿毒癥病理生理機制研究的不斷深入，目前認為炎癥反應在膿毒癥所引起的多器官功能障礙綜合征(MODS)的發生發展及轉歸中起最重要作用，是膿毒癥多個發病機制的基礎。在膿毒癥中，大量炎癥細胞激活及炎癥因子釋放造成組織器官損傷、血管擴張、血漿滲漏、氧供需障礙等，最終導致器官功能不全、MODS甚至多器官功能衰竭，引起患者死亡。本實驗使用盲腸結扎及穿刺術模擬腹腔臟器穿孔引起的膿毒癥，此方法能較好地模擬自然病程，是經典的膿毒癥模型[5]。筆者在實驗中觀察到膿毒癥模型大鼠較假手術組大鼠術后明顯萎靡、活動減少、顫抖、呼吸頻率加快，部分大鼠目內眥可見滲血；預實驗病理檢測提示明顯肺部病變，模型制作可靠。

白三烯(LTs)是一組具有生物活性的由花生四烯酸(AA)經5-脂氧合酶(5-LO)代謝生成的一組脂類遞質，包括白三烯A(LTA)、白三烯B (LTB)、白三烯C(LTC)、白三烯D(LTD)和白三烯E(LTE)。LTC、LTD和LTE統稱為半胱氨酰白三烯(CysLTs)，CysLTs通過CysLTR1起作用，其在機體內含量不高但廣泛參與變態反應及炎癥反應，是一種強有力的炎癥遞質及趨化因子[6-7]。Petersen等[8]研究提示，內毒素小鼠支氣管肺泡灌洗液中白三烯含量顯著增加，其可通過CysLTR1依賴的機制引起低氧性肺血管收縮。DeClue等[9]研究證實，CysLTR1抑制劑扎魯司特(Zafirlukast)可顯著改善內毒素所致的低血壓反應。Zhu等[10-11]研究發現，哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者支氣管黏膜中多種炎癥細胞CysLTR1表達均顯著增加，且與疾病嚴重程度相關。Yeh等[12]研究顯示，肝臟缺血-再灌注損傷顯著增加肺組織TNF-α含量和支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數，CysLTR1拮抗劑MK571處理可顯著減少肺組織炎癥浸潤和組織損傷程度。這些研究提示，阻斷CysLTR1介導的炎癥反應可能是防治膿毒癥組織損傷的新策略。

本研究病理檢查結果發現，膿毒癥組大鼠肺組織可見大量炎性細胞浸潤，肺泡結構破壞明顯，肺間質明顯水腫增厚，而 MK571干預組肺組織炎癥反應及肺泡結構損害程度顯著減輕，說明膿毒癥時炎癥細胞在肺組織趨化并聚集，與細菌毒素和炎癥因子一起對肺組織造成損傷，使肺組織結構破壞紊亂，肺泡閉合，并且使肺血管內皮屏障功能喪失，大量血漿成分及紅細胞等滲出。而MK571干預則可減輕上述病理改變，提示MK571可能通過拮抗CysLTR1的作用從而減輕內毒素及炎癥因子在肺組織的促炎癥作用，并有一定的血管內皮屏障穩定作用。本研究中膿毒癥組大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數明顯升高，提示膿毒癥過程中，遠離感染部位的肺臟受到血流中細菌毒素、炎癥細胞及炎癥因子的影響出現白細胞遷移浸潤；MK571干預組支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數顯著減少，證明MK571干預對炎癥細胞的浸潤遷移有一定的抑制作用。

血漿中炎癥因子增加是膿毒癥的典型特征之一，IL-1β、TNF-α及IL-6是主要的促炎癥細胞因子，其在炎癥時升高的多少可以反映炎癥反應的嚴重程度。本實驗中膿毒癥組術后12 h時血清IL-1β含量和術后24 h時血清TNF-α含量均顯著高于假手術組，MK571干預組二者含量均明顯降低，提示MK571不僅可減輕肺組織局部炎癥反應，還可能通過減輕感染原發灶的炎癥反應來減輕全身的炎癥反應程度，而事實上炎癥組織中的炎癥因子濃度要遠遠高于血漿中的水平，這也提示MK571在膿毒癥的炎癥過程中可能對其他器官及組織也具有一定的抗炎保護作用，如腎臟、肝臟、腦組織，但這有待進一步實驗證實。

綜上所述，膿毒癥大鼠肺組織呈現明顯炎癥狀態，血清炎癥因子水平升高，肺組織損傷明顯，MK571干預可顯著降低血清炎癥因子水平，可抑制炎癥細胞的浸潤遷移，對膿毒癥誘導的急性肺損傷有明顯保護作用。

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Effect of MK571 on sepsis-induced acute lung injury in rats

SU Bin, XIA Wenfang, ZHOU Qingshan, ZHENG Yanlei

(Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei,China)

Abstract:Objective It is to explore the effect of MK571 on sepsis-induced acute lung injury in rats. Methods Forty-five SD rats were randomly divided into three groups: sham-operated group, sepsis group, and sepsis plus MRP4 inhibitor treatment group(intervention group), with 15 rats in each group. Sepsis was induced by cecal ligation and puncture in sepsis group and intervention group. MK571 (25 mg/kg) was administrated by intraperitoneal injection 30 minutes before induction of sepsis in intervention group. Serum interlukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay at 12 hours and 24 hours after surgery respectively. At 24 hours after surgery, the lungs were collected for histopathological examination, and bronchoalveolar lavage fluid was harvested for white blood cell-counting. Results Compared with sham group, serum IL-6 and TNF-α levels were significantly higher in sepsis group. White blood cell count in bronchoalveolar lavage fluid was elevated and lung injury was increased in sepsis group compared to sham group. Importantly, MK571 treatment significantly decreased serum IL-6 and TNF-α levels, reduced white blood cell count in bronchoalveolar lavage fluid, and improved lung injury. Conclusion MK571 can effectively relieve acute lung injury in septic rats.

Key words:sepsis; lung injury; inflammation; MK571; rat

[收稿日期]2015-05-14

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)01-0001-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.01.001

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81301620)

[作者簡介]蘇鑌，男，碩士研究生在讀，主要從事膿毒癥時肺保護的研究。[通信作者]周青山，E-mail: zhtoo163@hotmail.com；夏文芳，E-mail: xiawenfang2004@sina.com