中藥組方熱水提取正丁醇相的HPLC-MS分析

楊　海，耿傳信，周學鋒，趙　峽，鄒　曉

(1. 山東省青島市中心醫院，山東 青島 266042；2. 中國海洋大學醫藥學院,山東 青島 266003;3. 山東省青島市腫瘤醫院，山東 青島 266042)

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中藥組方熱水提取正丁醇相的HPLC-MS分析

楊海1,2，耿傳信3，周學鋒1，趙峽2，鄒曉1

(1. 山東省青島市中心醫院，山東 青島 266042；2. 中國海洋大學醫藥學院,山東 青島 266003;3. 山東省青島市腫瘤醫院，山東 青島 266042)

[摘要]目的分析中藥組方水煎液正丁醇相的化學組分。方法采用高效液相色譜-質譜聯用法，以甲醇-水為流動相，梯度洗脫，流速為1 mL/min，ESI正離子模式進行質譜檢測，分子量掃描范圍為50～1 000 m/z。將檢測分子量數據與數據庫對比，對相似度得分在80以上的化合物進行文獻及來源藥材成分檢索，鑒定化合物。結果共鑒定巫山淫羊藿黃酮甙、淫羊藿屬甙C、脫水淫羊藿素-3-鼠李糖甙、2-甲基-5-丙酮基-7-羥基色酮等16個化合物，并對化合物的藥材來源進行歸屬。結論高效液相色譜-質譜聯用技術為中藥組方的成分鑒定提供了一種高效快速的方法，為中藥組方的臨床應用提供了理論依據。

[關鍵詞]中藥組方；水提取；正丁醇相；質譜分析

中藥復方是中藥臨床應用的主要形式，中藥物質基礎研究是中藥現代化的基礎，對于闡明中藥有效成分及其藥理作用意義重大[1-2]。建立快速高效的中藥組方成分分析方法，進而確定有效成分的協同作用是中藥研究的方向之一[3]。近年來由于液質聯用技術分析高效性、檢測靈敏性等特點，使得該技術在中藥組方中研究越來越廣。本研究對臨床應用多年且療效確切的一組中藥驗方采用HPLC-MS法進行成分鑒定，旨在為該組方的臨床使用提供理論依據和參考。

1實驗資料

1.1儀器與試藥液質聯用色譜儀采用Agilent 1260 Infinity液相色譜系統，Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 質譜分析儀，安裝Agilent Masshunter軟件工作站；色譜柱采用Agilent Zorbox SB-C18(4.6mm×150 mm,5 μm)；R-410型旋轉蒸發儀(瑞士Büchi公司)；DL-5低速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)；超純水儀(美國Milli-Q公司)；DZF-150型數顯小型恒溫真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)；SEC20/3+1型常溫二煎煎藥機(黃岡永安醫療器械有限公司)。供實驗用藥材均采購自芍花堂藥業股份有限公司，經青島市中心醫院主管中藥師趙海鑒定；甲醇(色譜級，美國ACS公司)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為國產分析純。0.22 μm微孔濾膜(上海亞東核級樹脂有限公司)。

1.2方法

1.2.1萃取按照中藥傳統水煎煮工藝進行中藥方的提取。按組方放大20倍，取中藥復方共3.6 kg，加水煎煮3次。第1次加10倍量水，提取2 h；第2次加8倍量水，提取1.5 h；第3次加6倍量水，提取1 h。煎煮液過濾，合并，減壓濃縮至濃縮液2.5 L左右。濃縮液依次用等體積的石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取3次，各相萃取液減壓濃縮干燥。選取正丁醇相進一步實驗。

1.2.2分析方法色譜條件：流動相為甲醇(A)-水(B)溶液；洗脫梯度：5%A(0～5 min)，5%～90%A(5～50 min)，90%A(50～51 min)；流速 1 mL/min；柱溫40 ℃；自動進樣1 μL。質譜條件：ESI正離子模式，分子量掃描范圍50～1 000 m/z，載氣流速12 L/min，載氣溫度：350 ℃，噴霧器壓力35 psi。

2結果

按“1.2.2”項下色譜及質譜條件所得的中藥方正丁醇相的總離子流色譜圖見圖1。將圖1的m/z([M+H]+)數據與Aglient中藥質譜數據庫進行檢索、對比，并通過查閱文獻及單味藥化學成分檢索，共鑒定17個化合物，鑒定結果見表1。

注：1. 巫山淫羊藿黃酮甙(wushanicariin)；2. 淫羊藿屬甙C(epimedoside C)；3. 脫水淫羊藿素-3-鼠李糖甙(anhydroicaritin-3-O-α-l-rhamnoside)；4. 2-甲基-5-丙酮基-7-羥基色酮(2-methyl-5-acetonyl-7-hydroxychromone)；5. 槲皮素(guercetol)；6. 4’-甲基茵陳色原酮(4’-methylcapillarisin)；7. 蒼術內酯Ⅱ(atractylenolide II)；8. 蒼術內酯I(atractylenolide I)；9. 龍葵螺甙B(uttronin B)；10. 茯苓新酸C(poricoicacid C)；11. 16α-羥基齒孔酸甲酯(tumulosicacidmethylester)；12. 掌葉大黃二蒽酮A(palmidin A)；13. 掌葉大黃二蒽酮B(palmidin B)；14. α-澳洲茄堿(α-solasonine)；15. β-澳洲茄邊堿(β-solamargine)；16. 替告皂甙元(tigogenin)。

圖1　中藥組方正丁醇相總離子流(ESI陽離子模式)色譜圖

3討論

近年來從經典方劑、臨床驗方、名老中醫優秀處方等挖掘新藥、新組方是中藥研發的主要策略之一。本研究的中藥驗方由山東省名老中醫提供，臨床應用多年。該組方由黃芪、白術、仙鶴草等11味中藥組成，主要應用于惡性腫瘤患者，特別是免疫力低下肺癌、胃腸道惡性腫瘤中晚期患者，能提高患者免疫力，改善生活質量，聯合放化療能提高治療依從性、減少放化療不良反應，起到減毒增效的作用[4]。

中藥組方藥效發揮通常是通過多靶點、多途徑協同作用[5-6]，對于整方的研究更能體現復方整體性及中醫整體觀理論，接近臨床應用實際，因此本研究采用傳統的水煎煮工藝，確保分析結果與藥效相一致。由于中藥成分的復雜性，為確保各組分有效分離，本研究采取甲醇-水梯度洗脫的方法，并適當延長洗脫時間。

在進行質譜分析時本研究采取ESI正離子模式，將所得的化合物精確分子量與數據庫進行檢索、對比，將相似度在80以上對比結果再次進行文獻檢索并將化合物的藥材來源進行歸屬。同一精確荷質比(M/Z)可能對應多個藥材來源不同化合物分子式，該方法難以鑒定，為此本研究在同一色譜條件下采取單藥組分流出時間與組方成分流出時間對比的方式，從而可以確定成分的藥材來源，進而確定結構。

總之，運用HPLC-MS法對中藥組方成分鑒定，研究方法可行，為該組方活性研究及擴大臨床應用提供數據支持，為發掘優秀中醫處方提供方法學參考。

[參考文獻]

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[2]李小娜，張蘭桐，殷瑋. 中藥復方藥效物質基礎研究途徑與方法[J]. 中草藥，2006，37(6)：801-806

[3]賈曉斌,陳彥,李霞,等. 中藥復方物質基礎研究新思路和方法[J]. 中華中醫藥雜志,2008,23(5):420-424

[4]耿傳信，王曉璐，仇淑真，等. 解毒化瘀方治療惡性腫瘤54例[J]. 中國藥業，2015，16(6):72-73

[5]李元濱,林麗珠. 中藥多靶點逆轉肺癌多藥耐藥機制研究[J]. 中國實驗方劑學雜志,2014,20(8)：232-236

[6]楊義芳,蕭偉. 基于多成分多靶點的中藥藥動/藥效相關性研究解讀與策略[J]. 中草藥,2013,44(12)：1521-1528

[收稿日期]2015-07-10

[中圖分類號]R284.2

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)04-0435-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.04.034

[基金項目]國家十二五科技支撐計劃(2013BAB01B02)；青島中醫科研計劃(2014-zyy022)

[通信作者]鄒曉，E-mail：qdzx08@163.com