丹參單體IH764-3對糖尿病腎病大鼠水通道蛋白表達的影響

胡　波，范紅偉，鮑軍強，王燕午，馬廣駿，李　鋒

(1. 解放軍第260醫院，河北 石家莊 050041；2. 河北省石家莊市第四醫院，河北 石家莊 050011；3. 第四軍醫大學附屬西京醫院，陜西 西安 710032)

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丹參單體IH764-3對糖尿病腎病大鼠水通道蛋白表達的影響

胡波1，范紅偉2，鮑軍強1，王燕午1，馬廣駿1，李鋒3

(1. 解放軍第260醫院，河北 石家莊 050041；2. 河北省石家莊市第四醫院，河北 石家莊 050011；3. 第四軍醫大學附屬西京醫院，陜西 西安 710032)

[摘要]目的觀察丹參單體IH764-3對糖尿病腎病大鼠腎臟水通道蛋白(AQP)2、AQP4及肺臟AQP1表達的影響，探討丹參單體IH764-3對糖尿病腎病大鼠水液代謝異常的調節機制。方法從60只SD大鼠中隨機選擇10只作為正常組，剩余50只采用高糖高脂飼料刺激加小劑量STZ誘導糖尿病腎病大鼠模型，將成模大鼠30只隨機分為模型組、對照組、研究組各10只。對照組給予卡托普利灌胃，研究組給予卡托普利灌胃同時腹腔注射丹參單體IH764-3，正常組和模型組灌胃等量蒸餾水。灌胃16周末處死大鼠，留取腎、肺組織行病理觀察，采用免疫組化法、Western blot印記法、RT-PCR法檢測腎組織中AQP2、AQP4及肺組織中AQP1蛋白及mRNA表達情況。結果腎組織中AQP2、AQP4蛋白及mRNA表達量模型組均明顯高于正常組(P均<0.05)，對照組、研究組均明顯低于模型組(P均<0.05)，研究組均低于對照組(P均<0.05)。肺組織中AQP1蛋白及mRNA表達量模型組均明顯低于正常組(P均<0.05)，研究組與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)，對照組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論AQP2、AQP4在腎臟組織表達的增多及AQP1在肺臟組織表達的減少可能是導致糖尿病水液代謝異常的重要機制之一。丹參單體IH764-3對水通道蛋白的表達有調節作用，這可能是其調節水液代謝作用的機制，也是其防治糖尿病腎病的基礎。

[關鍵詞]糖尿病腎病；水通道蛋白；丹參單體IH764-3

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。DN患者存在水液代謝紊亂，其中Ⅳ期DN患者中80%會出現水腫。祖國醫學認為腎臟和肺臟是體內水液代謝的重要臟器，水液代謝紊亂是糖尿病肺、腎損傷的獨立危險因素。前期研究表明：水通道蛋白家族(AQPs)在糖尿病及其微血管并發癥發生發展中起重要作用[1]。本研究進一步觀察了丹參單體IH764-3對水通道蛋白(AQP)2、AQP4、AQP1表達的影響，旨在探討AQP2、AQP4、AQP1的表達與DN水液代謝異常的關系以及丹參的藥理效應，為DN的預防和治療提供依據。

1實驗資料

1.1實驗動物4周齡雄性SPF級SD大鼠60只，體質量(165±12.5)g，河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：1312053。SPF級環境飼養，環境溫度20～25 ℃，12 h∶12 h晝夜規律，每籠5只。

1.2藥物卡托普利片(25 mg/片)，常州制藥有限公司生產，批號：32023731；丹參單體IH764-3，購自天津血液研究所；鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司。

1.3主要試劑與儀器AQP2兔多克隆抗體(sc-28629)、AQP4兔多克隆抗體(sc-20812)、AQP1兔多克隆抗體(sc-29612)、SABC試劑盒(sc-2081)、Actin (sc-1616)購自美國SANTA CRUZ公司。TRIZOL Reagent購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司，PCR試劑盒(M7122)購自美國Promega公司, 辣根酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。BCA法蛋白定量試劑盒購自北京百泰生物技術有限公司。GeneAMP PCR system 2400(Applied Biosystems)；UV-2501PC型分光光度計(日本島津儀器廠生產)；Miaspro圖像分析系統。

1.4實驗方法

1.4.1動物分組、造模及給藥隨機從60只大鼠中選擇10只作為正常組，給予普通飼料喂養；其余50只大鼠參照文獻[2]方法給予高糖高脂飼料(即普通飼料中加入10%豬油、10%葡萄糖、1%膽固醇、2%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉)喂養，在高糖高脂飼料喂養4周后尾靜脈注射STZ 30 mg/kg，以注射后1個月血糖值持續高于7.8 mmol/L、尿糖陽性為造模成功。將造模成功30只大鼠隨機分為模型組、對照組和研究組，每組10只。對照組給予卡托普利25 mg/(kg·d)灌胃，研究組在灌胃卡托普利的同時腹腔注射丹參單體IH764-3 40 mg/(kg·d)，正常組和模型組灌胃等體積的蒸餾水，均每天1次。實驗期間室溫保持在20～24 ℃，相對濕度40%。所有動物自由飲水，正常組給予普通飼料喂養，其余組給予高糖高脂飲食。

1.4.2肺、腎組織留取灌胃第16周末，用25%烏拉坦麻醉大鼠，打開腹腔，充分暴露兩側腎臟，取1/2的腎臟迅速放入4%多聚甲醛中固定，用于石蠟切片。開胸取肺組織，迅速放入裝有4%甲醛的瓶中固定。右肺中、下葉用于病理學觀察，左肺進行免疫組化染色。余下肺、腎組織用消毒鋁箔包好迅速放入液氮中，保存于-80 ℃冰箱中，備用于PCR樣本的提取。

1.4.3腎組織中AQP2、AQP4免疫組化檢測按試劑盒操作步驟進行加樣，以SABC法進行檢測，一抗為Rabbit anti-AQP2，4。細胞質中呈現棕黃色顆粒為陽性反應，采用Miaspro圖像分析系統進行分析。每組隨機取6只動物，每只動物AQP2、AQP4染色各取3張切片，觀察3個視野，視野面積480 000 mm2，測定陽性面積比[Aa(%)]，Aa(%) =陽性面積/視野面積。

1.4.4肺組織中AQP1免疫組化檢測按試劑盒操作步驟進行加樣，以SABC法進行檢測，一抗為Rabbit anti-AQP1。肺泡間質中微血管呈現棕黃色為陽性。每組隨機取6只動物，每只動物AQP1染色各取3張切片，各觀察3個視野，視野面積為480 000 mm2，免疫組化結果以單個視野下陽性微血管數表示。

1.4.5腎組織中AQP2、AQP4及肺組織中AQP1 mRNA表達檢測采用RT-PCR法檢測。引物采用Primer 5.0設計。AQP2、AQP4、AQP1和β-actin引物均由上海生工生物技術有限公司合成。用TRIZOL進行組織總RNA的提取，對總RNA進行定量；逆轉錄按試劑盒說明進行；電泳結束后用Image-Pro Plus對電泳條帶進行光密度分析，以目的條帶光密度參數與內參基因條帶的光密度參數比值作為該標本mRNA的表達水平參數。見表1。

表1　AQP2、AQP4、AQP1及β-actin

1.4.6腎組織中AQP2、AQP4及肺組織中AQP1蛋白表達檢測采用Western blot法檢測。用裂解液提取組織總蛋白，按BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，10%SDSPAGE電泳，轉移蛋白至硝酸纖維膜上。5%正常羊血清封閉，AQP2、AQP4、AQP1多克隆抗體(1∶400稀釋)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 500稀釋)孵2 h。化學發光法發光成像，以actin為內參照，對目的蛋白表達水平進行半定量分析。

1.5統計學方法數據用SPSS 16.0統計軟件進行分析，采用One-way ANOVA法進行方差分析。兩兩比較時根據其方差是否齊性選擇LSD或Dunnett C方法。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠一般狀況正常組大鼠體質量穩定增長，皮毛光澤，一般情況好；模型組大鼠出現多飲、多食、多尿，早期體質量有不同程度增加，8周后一般情況變差，體質量下降，毛發失去光澤，后期出現腹脹。對照組和研究組大鼠的一般情況較好，體質量比較穩定，“三多一少”癥狀較模型組明顯減輕，沒有觀察到腹脹。

2.2各組大鼠腎組織病理表現正常組腎小球結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，基底膜完整，間質中未見炎癥細胞浸潤、纖維組織增生，見圖1；模型組腎小球明顯肥大，系膜區增寬，系膜細胞增生、基質增多，血管壁增厚，球內可見大量紅細胞淤積，腎小管上皮細胞彌漫性空泡狀變性、腫脹脫落，部分腎小管內有蛋白管型淤積，見圖2；對照組上皮細胞空泡狀變性呈片狀，腎小球內可見紅細胞淤積，腎小管偶見上皮細胞脫落，小管內可見蛋白管型，見圖3；研究組上皮細胞空泡狀變性呈局灶狀，僅存在于腎被膜下，腎小球內少見紅細胞淤積，腎小管未見上皮細胞脫落，小管內少見蛋白管型，見圖4。

圖1　正常組腎組織HE染色表現(×100)

圖2　模型組腎組織HE染色表現(×100)

2.3各組大鼠肺組織病理學表現正常組肺組織肺泡無萎陷，肺泡壁無增厚，肺泡間隔無增寬，肺泡和肺間質無炎細胞浸潤，見圖5；模型組肺泡腔縮小，肺泡數量增多，肺泡隔明顯增寬，成纖維細胞數量增加，毛細血管基底膜增厚，血管擴張淤血，腔內充滿紅細胞，有較多中性粒細胞浸潤，見圖6；研究組和對照組肺組織上述改變減輕，見圖7及圖8。

圖3　對照組腎組織HE染色表現(×100)

圖4　研究組腎組織HE染色表現(×100)

圖5　正常組肺組織HE染色表現(×100)

圖6　模型組肺組織HE染色表現(×100)

圖7　研究組肺組織HE染色表現(×100)

圖8　對照組肺組織HE染色表現(×100)

2.4各組腎組織中AQP2、AQP4免疫組化染色表現正常組AQP2、AQP4蛋白在腎集合管表達，而在腎小球和腎間質未見表達；模型組AQP2、AQP4蛋白沿集合管內壁上皮細胞分布的棕黃色顆粒比正常組顏色加深而濃厚，分布面積廣泛；對照組和研究組AQP2、AQP4的棕黃色顆粒顏色比模型組明顯變淺，分布面積減小。見圖9～16。

圖9　正常組腎組織中AQP2免疫組化染色表現

圖10　模型組腎組織中AQP2免疫組化染色表現

圖11　對照組腎組織中AQP2免疫組化染色表現

2.5各組肺組織中AQP1免疫組化染色表現正常組中肺泡周圍和支氣管周圍的毛細血管內皮及肺泡上皮均有AQP1陽性染色(棕黃色)，且毛細血管內皮整個周緣較肺泡上皮陽性染色強，提示AQP1主要表達于肺毛細血管內皮細胞，見圖17；模型組AQP1在毛細血管內皮細胞表達明顯減少，見圖18；研究組AQP1免疫組化染色表現與正常組相似，見圖19；對照組AQP1免疫組化染色表現與模型組相似，見圖20。

圖12　研究組腎組織中AQP2免疫組化染色表現

圖13　正常組腎組織中AQP4免疫組化染色表現

圖14　模型組腎組織中AQP4免疫組化染色表現

圖15　對照組腎組織中AQP4免疫組化染色表現

圖16　研究組腎組織中AQP4免疫組化染色表現

圖17　正常組肺組織中AQP1免疫組化染色表現

圖18　模型組肺組織中AQP1免疫組化染色表現

圖19　研究組肺組織中AQP1免疫組化染色表現

圖20　對照組肺組織中AQP1免疫組化染色表現

2.6各組大鼠腎組織中AQP2、AQP4和肺組織中AQP1 mRNA表達量比較模型組腎組織中AQP2和AQP4 mRNA表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)；研究組和對照組AQP2、 AQP4 mRNA表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，研究組均明顯低于對照組(P均<0.05)。模型組肺組織中AQP1 mRNA表達量明顯低于正常組(P<0.05)，研究組AQP1 mRNA表達量明顯高于模型組和對照組(P均<0.05)，對照組AQP1 mRNA表達量與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　各組大鼠腎組織中AQP2、AQP4和肺組織中

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與對照組比較，P<0.05。

2.7各組大鼠腎組織中AQP2、AQP4和肺組織中AQP1蛋白表達量比較模型組腎組織中AQP2、AQP4 蛋白表達量均明顯高于正常組(P均<0.05 )；對照組大鼠腎組織中AQP2、AQP4蛋白表達量與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，研究組大鼠腎組織中AQP2、AQP4蛋白表達量明顯低于模型組與對照組(P均<0.05)。模型組肺組織中AQP1蛋白表達量明顯低于正常組(P<0.05)，研究組AQP1蛋白表達量明顯高于模型組和對照組(P均<0.05)，與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)；對照組AQP1蛋白表達量與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　各組大鼠腎組織中AQP2、AQP4和肺組織中

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與對照組比較，P<0.05。

3討論

糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，消渴日久則出現的“水腫”“脹滿”“尿濁”“關格”與現代醫學DN的臨床癥狀相似。《景岳全書·腫脹》篇說：“凡水腫等證，乃肺脾腎三臟相干之病，蓋水為至陰，故其本在腎-其標在肺-其制在脾。”《素問·水熱穴論》曰:“腎者,胃之關也。關門不利，故聚水而從其類也，上下溢于皮膚，故為胕腫。胕腫者，聚水而生病也。”《素問·經脈別論》說：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調水道，下輸膀胱，水精四布，五經并行。”在水液代謝過程中，腎氣的氣化、開合功能起著十分重要的作用。“腎陽為開”“腎陰為合”,腎陰腎陽不平衡,開合失調,將導致人體尿量失常；只有腎陰腎陽平衡,水液的排出才能正常適量。

目前西醫研究發現，AQPs的表達異常與DN的發生、發展和轉歸密切相關。其中AQP1表達于肺泡周圍的毛細血管內皮細胞，其主要作用是調節肺內毛細血管與肺泡間水通透性。有資料顯示AQP1基因敲除小鼠肺滲透壓依賴的被動性水轉運被抑制90%[3]。尿液的濃縮稀釋功能主要由腎臟集合管主細胞的AQP2、AQP4來完成。血管加壓素(AVP)與腎組織集合管主細胞基底膜上的AVP V2受體結合后，使細胞內cAMP濃度升高，激活PKA，將AQP2蛋白磷酸化，使之從囊泡穿梭到管腔膜，從而提高集合管對水的通透性[4]，同時該信號可刺激AQP2的合成，提高AQP2 mRNA和蛋白水平的表達，從而實現AVP的抗利尿作用。既往研究表明在糖尿病大鼠中血AVP水平升高[5]，這可能與水鈉潴留有關。AQP2 、AQP4缺陷或突變則會嚴重影響尿液的濃縮能力，從而出現腎源性尿崩癥[6]。

丹參具有活血祛瘀、清心除煩、涼血消癰等功效，在《神農本草經》中被奉為上品，有“一味丹參，功同四物”之稱。現代藥理研究顯示，丹參具有醛糖還原酶抑制劑的作用，而醛糖還原酶抑制劑可以減少山梨醇及其他糖化終末產物的形成，對治療和預防糖尿病慢性并發癥有一定作用[7]。丹參還可以擴張血管，加快血液流速，從而改善微循環，因此“血行則水行”，局部的水腫狀態得以改善[8-9]。丹參的有效單體IH764-3及其脂溶性成分丹參酮、水溶性成分丹參素等有增加腎血流、利尿和抗炎作用，可降低血BUN、SCr，調節腎組織局部微循環，改善腎功能[1]。且前期的研究已證實丹參對腎組織AQP2及肺組織AQP1均有調節作用[10]。本研究結果表明丹參單體IH764-3聯合卡托普利能顯著改善“三多一少”癥狀，能顯著降低DN大鼠腎組織中AQP2、AQP4蛋白及mRNA表達量，提高AQP1蛋白及mRNA在肺組織中的表達，因此推測丹參單體IH764-3對DN大鼠腎臟的保護作用可能與降低AQP2、AQP4，導致AQP2、AQP4在腎臟集合管重新分布有關，升高AQP1的表達改變微血管通透性，以減輕糖尿病病變臟器的水腫病理狀態有關。但丹參單體IH764-3改善水液代謝作用機制是如何通過改變DN時肺組織AQP1的表達和腎組織AQP2及AQP4在腎臟集合管分布部位而發揮作用的，有待進一步深入探討。

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Regulatory effect of Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 on the expression of Aquaporin in rats with diabetic nephropathy

HU Bo1, FAN Hongwei2, BAO Junqiang1, WANG Yanwu1, MA Guangjun1, LI Feng3

(1. The 260th Hospital of PLA, Shijiazhuang 050041, Hebei, China; 2. The Fourth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, Hebei, China; 3. Xijing Hospital Affiliated to the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of expression of Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 on the expression of Aquaporin 2 (AQP2), AQP4 in kidney and AQP1 in lung in rats with diabetic nephropathy, so as to explore the the regulating mechanism of Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 for body fluid metabolism abnormality. Methods 60 healthy SD rats were selected, among which ten as control group, and the other 50 ones were used to establish diabetes model by high glucose and lipoids feeder and low-dose STZ. They the successful models (n=30) were randomly divided into 3 groups: model group, control group and study group, with 10 rats in each group. The control group was given captopril by gavage, study group was given captopril by gavage combined with IH764-3 by intraperitoneal injection, normal group and control group were given distilled water at the same dose. After 16 weeks’ treatment, the rats were killed to get their lung and renal tissue for pathological observation. The expression of protein and mRNA of AQP2,AQP4 in renal tissue and AQP1 in lung tissue were detected by immunohistochemistry method, Western blot method, RT-PCR method. Results The expression of protein and mRNA of AQP2 and AQP 4 in renal tissue in model group was higher than that in normal group (P<0.05), and that in control group and study group was lower compared with the model group (P<0.05), in study group was lower compared with control group (P<0.05). The expression of protein and mRNA of AQP1 in lung tissue in model group was lower than that in normal group (P<0.05),there was no significant difference in the indexes between study group and normal group (P>0.05), control group and model group (P>0.05). Conclusion The increase of AQP2 expression in renal tissue and decrease of AQP1 expression in pulmonary tissue may be one of the important mechanism which could induce body fluid metabolism abnormality. Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 had regulatory effect on AQP expression, which may be the mechanism it regulates body fluid metabolism as well as the basis for preventing and treating diabetes.

Key words:diabetic nephropathy Aquaporin；Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3；Streptozotocin

[收稿日期]2015-09-03

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)07-0693-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.07.003

[基金項目]全軍青年培育項目(13QNP187)

[作者簡介]胡波，男，主治醫師，研究方向為糖尿病腎病的防治。