SCID Beige 與NOD.CB17-Prkdcscid 小鼠主要免疫指標測定

袁水娟, 施國君, 唐慧青, 許文靜, 符 杰, 施美蓮

(1. 上海靈暢生物科技有限公司, 上海 201402; 2. 上海斯萊克實驗動物有限責任公司, 上海 201615)

SCID Beige 與NOD.CB17-Prkdcscid 小鼠主要免疫指標測定

袁水娟1, 施國君1, 唐慧青1, 許文靜1, 符 杰2, 施美蓮2

(1. 上海靈暢生物科技有限公司, 上海 201402; 2. 上海斯萊克實驗動物有限責任公司, 上海 201615)

目的 測定SCID Beige (簡稱SCID.BG)小鼠與NOD.CB17-Prkdcscid (簡稱NOD.SCID)小鼠主要免疫球蛋白(Ig)、補體(C)、免疫細胞指標，分析兩種免疫缺陷小鼠在免疫方面差異。方法選擇4周齡、8周齡、16周齡的SCID.BG小鼠、NOD.SCID小鼠各30只(雌雄各半)，測定主要免疫球蛋白、補體指標; 選擇8周齡的SCID.BG小鼠、NOD.SCID小鼠各14只(雌雄各半)，測定T細胞及亞群、B細胞、NK細胞免疫指標。結果 3個年齡段的SCID.BG在IgG水平上顯著低于NOD.SCID，在IgA水平上顯著高于NOD.SCID; 4周齡、16周齡的SCID.BG在C4水平上顯著高于NOD.SCID; 8周齡 SCID.BG小鼠與NOD.SCID小鼠在IgG水平上均顯著低于其他兩個周齡; T細胞亞群中，8周齡 SCID.BG的CD4+CD8+百分比顯著低于NOD.SCID; SCID.BG小鼠與NOD.SCID小鼠同品系同周齡在性別上各項指標均無顯著差異。結論 SCID.BG與NOD.SCID抗體、補體、免疫細胞水平含量均遠低于正常小鼠的水平，同屬于T、B、NK重度免疫缺陷動物，兩品系同周齡同性別比較各項免疫指標各有高低，在實驗中可以根據不同的研究目的選擇動物。

SCID Beige (SCID.BG)小鼠; NOD.CB17-Prkdcscid (NOD.SCID)小鼠; 免疫球蛋白(Ig);補體 (C); 免疫細胞

自l987年Reddy等[1]首次在C.B-17 SCID小鼠體內移植成功人類肺腺癌開始, 人惡性B細胞、原始淋巴瘤細胞、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、睪丸癌、卵巢癌等多種人類實體瘤成功移植于SCID等重癥聯合免疫缺陷小鼠, 為深入探索人類惡性腫瘤的發生機理、生長轉移規律及治療方法提供了良好的活體模型[2]。NOD.SCID小鼠是CB-17 SCID小鼠與NOD小鼠反交產生的, 該系小鼠既擁有CB-17 SCID小鼠缺乏適應性免疫系統、不再發生自身免疫性非胰島素依賴性糖尿病的特征，同時又擁有NOD小鼠具備的多種固有免疫缺陷, 包括自然殺傷(NK)細胞活性低、骨髓功能發育不正常。相對于CB-17 SCID小鼠90%發生免疫滲漏, NOD.SCID小鼠僅有不到10%發生滲漏[3]。SCID.BG小鼠是1993年Mosier等[4]利用BALB/c.BG/BG同類近交系小鼠,將BG基因引入CB-17SCID小鼠后產生的，BG基因突變導致小鼠體內NK細胞活性降低。相對于NOD.SCID小鼠, SCID.BG免疫缺陷小鼠應用尚不廣泛。有報道[5]用SCID.BG小鼠注射體外擴增人類NK細胞，提示NK細胞制劑在治療人類惡性血液病試驗中使用的可能性，也有報道[6]使用人類淋巴細胞移植于SCID.BG小鼠，無抗宿主反應風險，可用于人類移植免疫研究。本文對SCID.BG小鼠與NOD.SCID小鼠進行主要免疫指標免疫球蛋白、補體、免疫細胞測定與比較。

1 材料與方法

1.1 動物來源

4周齡、8周齡、16周齡SPF級SCID.BG小鼠、NOD.SCID小鼠各30只(雌雄各半)，由上海靈暢生物科技有限公司提供 [SCXK(滬)2013-0018]。

1.2 環境及飼養管理

實驗用小鼠飼養在上海靈暢生物科技有限公司隔離器中, 隔離器內的空氣為100級全新風, 室內溫度22～26 ℃, 相對濕度40%～60%, 換氣次數每小時20次, 光照明暗交替12 h∶12 h, 動物自由飲食。

小鼠用飼料、墊料為上海普路騰生物科技有限公司提供[滬飼證(2014)04001], 經35 kGy60Co輻照，飼料的營養成分為：粗蛋白24.5%～25.5%，粗脂肪5.5%～6.5%，粗灰分6.0%～6.5%，粗纖維4.0%～4.5%, 水份≤10%，鈣1.2%～1.5%，磷0.75%～1.0%，賴氨酸≥1.32%，蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。飲用水為酸化過濾純水, pH值2.5～3.5,并經121 ℃ 、40 min高壓蒸汽滅菌。墊料每周更換一次，進出隔離器的物品均進行121 ℃, 30 min消毒滅菌處理。

1.3 主要儀器

日本日立7020全自動生化分析儀，德國eppendorf 5427R離心機, 美國BD公司流式細胞儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物采血 質量分數4%水合氯醛溶液按體質量10 mL/kg腹腔注射麻醉，眼眶靜脈采血后脫頸椎處死。

1.4.2 血液生化相關免疫指標測定 取0.8 mL全血于4 ℃冰箱放置1 h后以2 800×g離心10 min，分離出血清，用日立7020全自動生化儀檢測免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)和補體(C3、C4)。

1.4.3 免疫細胞測定 動物處死后取脾臟，盡量去除附著其上的脂肪組織，放入淋巴細胞分離液，研磨，將分離液轉移至15 mL離心管內，覆蓋200～500 μL的1640培養基, 800×g離心30 min, 吸出淋巴細胞層, 再加入10 mL 1640培養基, 250×g離心10 min收集細胞，傾倒上清液，流式細胞儀細胞計數，測定T細胞及亞群、B細胞(B220+)、NK細胞(NK1-1+)。

1.5 結果處理

實驗結果用軟件SPSS 17.0分析, 數值以平均值±標準差表示。 主要免疫球蛋白和補體指標進行LSD法單因素方差分析。主要免疫細胞采用非參數檢驗分析, U檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 主要免疫球蛋白和補體指標測定

兩品系同性別同周齡比較，各周齡SCID.BG在IgG水平上顯著低于NOD.SCID，在IgA水平上顯著高于NOD.SCID; 16周齡 SCID.BG在C3水平上顯著低于NOD.SCID; 4周齡、16周齡 SCID.BG在C4水平上顯著高于NOD.SCID(表1)。兩品系同品系同周齡不同性別比較均無顯著差異。同品系同性別不同周齡比較，8周齡 SCID.BG 、NOD.SCID IgG水平顯著低于4周齡和16周齡; 16周齡 NOD. SCID的 C4值顯著低于4周齡和8周齡。在補體含量上，兩個品系均顯示含量最高的是補體C3，含量最少的是補體C4。

表1 3個周齡SCID.BG、NOD.SCID主要免疫球蛋白和補體指標

2.2 8周齡小鼠主要免疫細胞指標測定

由表2免疫細胞測定的百分比數據可見, B220、NK1-1在整體免疫細胞占比大于T細胞群。SCID.BG小鼠在T細胞亞群中占比例最低為CD4+CD8+, 且顯著低于NOD.SCID小鼠。同品系在性別上無顯著差異。

表2 SCID.BG、NOD.SCID主要免疫細胞指標 %

3 討論

免疫球蛋白是血清或體液中一類具有抗體活性的蛋白質，主要是丙種球蛋白，具有抗菌、抗病毒作用和加強細胞的吞噬作用，并在補體的協同作用下，殺死或溶解病原微生物，是機體抗感染免疫中的重要防御機制。補體是一組存在于人和動物體液中及細胞表面，經活化后具有生物活性，可介導免疫和炎癥反應的蛋白。實驗結果顯示，SCID.BG、NOD.SCID同品系同周齡在性別上各項指標均無顯著差異。SCID.BG各周齡段在IgG水平上數值均顯著低于NOD.SCID, 在IgA水平上數值均顯著高于NOD.SCID?？蒲腥藛T在做實驗時需有針對性地選擇動物品系。

實驗結果顯示，SCID.BG、NOD.SCID兩個品系的免疫缺陷動物，與免疫正常小鼠相比，其抗體含量均遠低于正常小鼠的水平[7]。兩個品系與T、B雙缺陷免疫動物CB-17SCID(簡稱SCID)小鼠相比，SCID.BG與SCID免疫球蛋白和補體水平相近，但SCID小鼠品系同性別間有差異，而SCID. BG不存在性別間的差異[8]。NK細胞是非特異性免疫應答中主要的效應細胞，在抗病毒過程中發揮重要作用，有文獻報道[9]，SCID小鼠的NK細胞活性為普通小鼠的4倍，且SCID有嚴重的滲漏的現象，在免疫學研究時需剔除較多個體滲漏動物。相對與SCID小鼠，SCID.BG、NOD.SCID兩個品系的免疫缺陷動物更適用于免疫學的研究。

本實驗采用脾臟組織進行細胞分離, 測定T細胞及亞群、B細胞和NK細胞的百分比含量, 結果顯示B220、NK1-1在整體免疫細胞中占比大于T細胞群, 說明B細胞和NK細胞活性大于T細胞活性。此結果與外周血免疫細胞實驗結果相比[8-10], 脾臟細胞實驗中CD3+、B220、NK1-1明顯高于外周血的百分比含量, 說明這些免疫細胞在脾細胞中的含量更高。

T細胞是免疫系統的重要組成部分，它的分化發育經歷CD4-CD8-雙陰性T細胞的早期階段，CD4+CD8+雙陽性的中期階段, 分別進行陽性和陰性選擇發育成只表達CD4+或CD8+的單陽細胞的后期階段。國外有關于CD4-CD8-雙陰性和CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞的報道[11,12]顯示, CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞具有比CD4+細胞更強的溶細胞效應,在下調MHC-I類分子的病毒感染中具有重要作用;另據資料表明[13,14], CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞還具有抗原特異性功能, 能夠產生疫苗誘導的記憶免疫誘答。本實驗結果表明, 8周齡SCID.BG小鼠CD4+CD8+雙陽性T淋巴細胞百分比顯著低于NOD.SCID, 顯示SCID.BG小鼠可能更適合用于此類研究。

通過以上兩個小鼠品系主要免疫指標測定與比較結果證實, SCID.BG與NOD.SCID兩者的抗體、補體, 免疫細胞指標都處于微量水平, 同屬于T、B、NK重度免疫缺陷動物, 可廣泛用于人體免疫功能重建和腫瘤學、血液學、免疫學等方面的研究。

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Detection of Main Immune Indexes in SCID. Beige and NOD.CB17-Prkdcscid Mice

YUAN Shui-juan1, SHI Guo-jun1, TANG Hui-qing1, XU Wen-jing1, FU Jie2, SHI Mei-lian2
(1. Shanghai Lingchang Bio-tech Company Limited, Shanghai 201402, China; 2. Shanghai SLAC Laboratory Animal Company Limited, Shanghai 201615, China)

ObjectiveTo measure the immunoglobulin, complement and main immune indexes in SCID. Beige and NOD.SCID mice and analyze their difference.MethodsThirty SCID.Beige and thiry NOD.SCID mice, half male and female, at the age of 4 weeks, 8 weeks and 16 weeks were selected for detecting the main immunoglobulin and complement indexes. Another fourteen SCID.Beige and fourteen NOD.SCID mice, half male and female, at the age of 8 weeks were also selected for detecting the T, B lymphocyte function and NK cell activity.ResultsThe IgG of SCID.Beige at all the age stages were significantly lower than those of NOD.SCID, but the IgA were significantly higher than those of NOD. SCID.The serum C4 of SCID.Beige mice at the age of 4 weeks and 16 weeks were significantly higher than those of NOD.SCID. The IgG of SCID.Beige and NOD.SCID mice at the age of 8 weeks were significantly lower than the other two age stages. In the T cell subsets, the CD4+CD8+percentages of SCID.Beige mice at the age of 8 weeks were significantly lower than those of NOD.SCID. Among the same sex and age group of NOD.SCID and SCID.BG, the immune indexes show no obvious differences .ConclusionsThe antibodies, complement and immune cell levels of SCID.Beige and NOD.SCID are significantly lower than normal mice. They all belong to severe immunodeficiency animals. Among the same age and sex group of the two strains, the immune indexes were different. So the animals should be selected according to the research purpose in the experiments.

SCID.Beige mice; NOD.CB17-Prkdcscid mice; Immunoglobulin; Complement; Immune cells

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0365-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.008

2016-06-17

上海市科委實驗動物研究專項(13140900500)

袁水娟(1981-), 女, 畜牧師, 從事實驗動物生產及管理。E-mail: ysjdyx123@163.com

施美蓮(1965-), 女, 高級畜牧師, 從事實驗動物保種、育種、免疫缺陷動物的研究以及實驗動物營養學研究。E-mail: mlshi@slaccas.com