應用胚胎干細胞模型研究環境內分泌干擾物胚胎毒性的展望

馬明月

(沈陽醫學院公共衛生學院，遼寧沈陽110034)

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應用胚胎干細胞模型研究環境內分泌干擾物胚胎毒性的展望

馬明月

(沈陽醫學院公共衛生學院，遼寧沈陽110034)

[摘要]動物實驗研究證明，環境內分泌干擾物具有一定的胚胎毒性，但動物實驗具有一定的局限性，尋找替代動物實驗的體外實驗模型至關重要。目前，胚胎干細胞已成為發育毒性實驗的一種嶄新受試對象，能靈敏、準確地評價有害物質的毒性作用。根據胚胎干細胞特性發展起來的胚胎干細胞模型，可評價環境內分泌干擾物的潛在胚胎毒性和致畸性。

[關鍵詞]胚胎干細胞；環境內分泌干擾物；胚胎毒性

環境內分泌干擾物(environmental endocrine disruptors，EEDs)是指環境中天然存在或污染的，可模擬生物體內激素生理、生化作用，干擾內分泌系統功能，對親體或后代產生不良健康效應的外源化學物。鄰苯二甲酸酯(phthalate esters， PAEs)作為最具代表性的EEDs[1]，每年全球范圍內的使用量很大，廣泛應用于兒童玩具、醫療用品、食品包裝材料、化妝品中。由于在塑料制品加工過程中，PAEs并未聚合到PVC高分子的碳鏈上，隨著時間的推移，可不斷地被釋放出來。PAEs難以被降解，廣泛存在于土壤、水域、空氣中，造成環境污染。人類尿液、血液、乳汁中均可檢測到多種PAEs及其代謝產物[2-4]。近年來，許多證據顯示PAEs暴露與出生缺陷、生殖異常和代謝相關性疾病密切相關[5-7]。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)是PAEs中使用最多的化學物，可通過消化道、呼吸道、皮膚等多種途徑進入人體，亦可通過胎盤屏障進入胎兒體內，在胎兒體內聚集[8]。但EEDs的胚胎毒性研究還主要停留在動物實驗階段，利用胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)建立發育毒物體外預測模型，可評價化學物的潛在胚胎毒性和致畸性。本文就DEHP等EEDs的胚胎毒性，ESC在胚胎發育毒性研究中的應用、優勢及應用ESC模型研究EEDs胚胎毒性的意義進行綜述。

1DEHP胚胎毒性研究的進展

大量動物研究證明DEHP具有胚胎毒性，影響胚胎、胎兒發育。早在1994年，Hansen等[9]應用大鼠全胚胎培養(whole embryo culture，WEC)證實DEHP原形直接作用于胚胎影響其生長和發育；Robinson等[10]通過大鼠植入后WEC，研究了DEHP的活性代謝產物鄰苯二甲酸單(2-乙基)己酯(mono(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP)對WEC的轉錄組基因表達變化和形態異常的關系，結果發現MEHP可以誘導膽固醇-脂質-類固醇代謝(CLS)增強和凋亡途徑，較經典形態學改變更為敏感。因此，調控CLS代謝途徑與PAEs宮內暴露導致的發育毒性相關[11]。在妊娠早期暴露DEHP體內實驗中，母體肝臟中金屬硫蛋白-1(metallothionein，MT-1)、金屬硫蛋白-2(metallothionein，MT-2)、鋅運轉體蛋白(zinc transporter， ZnT-1)表達上升，而胎鼠腦組織中MT-1、MT-2和ZnT-1表達下降，因此鋅代謝紊亂可能與DEHP 的胚胎毒性有關[11]。孕期DEHP暴露通過表觀遺傳機制影響某些維持胚胎正常發育的印記基因的表達，進而影響胚胎和胎盤發育[12]。最新的研究表明PAEs及雙酚A等EEDs阻礙正常的胚胎發育，是通過影響發育的某一階段表觀遺傳調控導致表型的變化，并且這些變化能夠長久地遺傳給后代[13-14]。實驗技術手段以及醫學倫理學限制了早期胚胎宮內研究，且研究主要停留在動物實驗階段，這使得EEDs對胎兒宮內發育的影響及其可能的機制知之甚少[15]。

2ESC在胚胎發育毒性研究中的應用及優勢

近二十年來，隨著干細胞研究方法的日臻成熟，ESC已成為發育毒性實驗的一種嶄新受試對象，能靈敏、準確地評價有害物質的毒性作用[16-17]。在適當的體外培養條件下，ESC能分化出包括原始外胚層、內胚層以及早期中胚層的多種細胞譜系，并產生各種細胞類型。由于缺乏空間調控信號，ESC不能完成各組織的形態發育，但能在細胞核分子水平重演胚胎發育過程，并且在胚體分化過程中，早期胚胎發育的標志基因按一定的順序先后表達，同時各組織特異性基因的表達的順序也很好地重演了體內胚胎發育的基因表達模式[18-19]。

評價化學物的潛在胚胎毒性和致畸性可利用ESC建立發育毒物體外預測模型。ESC具有著床前細胞特性以及細胞毒性、增殖和分化的多終點評價特性，明顯提高ESC測試模型(embryonic stem cell test，EST)篩選的有效性。自2000年7月ECVAM (the European Center for the Validation of Alternative Methods)正式批準EST作為體外藥物和化合物毒性篩選動物實驗的替代方法，目前這種毒性檢測手段已為學術界普遍接受，并且作為重要的研究手段，已經應用于毒理學研究中[20-21]。但在化學物安全評價中仍然存在實驗結果外推到人的問題。

人ES細胞系(human embryonic stem cell，hESC)來自人類早期胚胎，代表人類的特征，不存在動物實驗所特有的實驗結果必須外推到人的問題[22]。Pal等[23]以DNA細胞周期分析、生殖層特異性標記表達和激素水平為終點評價毒物對ESC的增殖和分化的影響，從而預測毒物潛在的胚胎發育毒性。2013年，Palmer等[24]開發了一種基于hESC和代謝組學分析結合的方法，通過將hESC暴露于23種已知人類致畸物和非致畸物，然后從細胞代謝產物中鑒別出特異性的代謝產物，作為致畸性生物標志物。生物標志物具有敏感、特異、簡便、無損傷等特點，篩選和利用其特性，可早期預測環境有害因素對機體的可能損害，并可評價其危險度，對于提出切實可行的預防措施有著重大意義。利用hESC和代謝組學相結合的方法去尋找發育毒性的生物標志物，對預測藥物及化學物的發育毒性提供了新的思路。

ESC具有多能性和自我更新能力，一定條件下又能產生不可逆的分化。OCT-4和Nanog在保持ESC的基本特性中被認為是2個基本調節器，SOX-2通過與OCT-4組成異二聚體發揮協同調控作用。三者的表達水平和功能狀態直接對ESC干性維持及生物的早期發育產生影響。

隨著表觀遺傳學研究的深入，發現表觀遺傳的動態調控在ESC的自我更新和分化過程中扮演著非常重要的角色[25]。ESC在分化過程中需要經歷長期不間斷的基因表達過程，在這一過程中，與自我更新相關的基因是沉默的，而與細胞分化相關的特異基因被轉錄激活[26]。與ESC分化相關的表觀遺傳機制包括：DNA的甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA。最近動物研究表明EEDs(PAEs和雙酚A)宮內暴露引起的表觀遺傳改變可以持續在整個生命階段誘導基因表達的改變，導致子代出生后生殖功能異常[27]；母體暴露DEHP，仔鼠睪丸DNA甲基化和DNA甲基轉移酶的表達水平明顯升高[26]。上述體內實驗證明EEDs可以通過表觀遺傳機制影響胚胎發育并導致傳代效應，但其分子機制尚未闡明。

3應用ESC模型研究EEDs胚胎毒性的意義

hESC作為一種新的體外受試細胞，可以替代哺乳動物的整體實驗，為環境化學物的毒理研究提供豐富細胞來源。毒性物質的定性或定量實驗都能夠反映其對細胞生長、分化以及生物學行為的影響。由于ESC的分化通常伴隨著明顯的細胞形態和功能的改變，不同的組織、細胞的甲基化模式導致基因表達的特異性。此外，受外界環境的影響，甲基化的DNA更容易發生變化，進而導致基因組的不穩定，改變染色質中組蛋白的乙酰化排列方式，可能構成基因表達的另外一種編碼[28]。

應用hESC作為體外實驗模型來研究表觀遺傳影響胚胎發育是非常有價值的，因為體外hESC誘導擬胚體的形成與胚胎發育的早期階段是非常相似的。加之，動物研究證實母體接觸DEHP能影響胚胎發育，引起子代生殖功能異常，并具有傳代效應[29]。值得深入研究的是：(1)EEDs如何引起在胚胎發育早期表觀遺傳學的改變？(2)這些改變通過什么分子靶點來影響ESC干性維持和定向分化？(3)并且對ESC造成怎樣的影響？(4)這些影響又如何體現在ESC分泌產生一些小分子的生物標志物。因此，采用ESC為實驗模型，分析EEDS對ESC干性維持及定向分化過程中關鍵基因所導致的表觀遺傳學影響；通過將表觀遺傳學理論和代謝組學技術相結合，闡明EEDs在胚胎發育早期對ESC的影響及分子機制，篩查敏感、特異、無損傷的早期生物標志物和胚胎發育毒性研究具有深遠意義。

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(文敏編輯)

Research Progress of Environmental Endocrine Disruptors on Embryotoxicity by Embryonic Stem Cell Test

MA Mingyue

(School of Public Health,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

[Abstract]Animal experimental studies demonstrated that environmental endocrine disruptors(EEDs) led to embryotoxicity.The evaluation of embryotoxicity by the animal experimental has some limitation.Replacing animals experiment has become an important role in developmental toxicology.At present,embryonic stem cells have become a new subject of developmental toxicity test.And it can assess sensitively and accurately the toxic effect of xenobiotics.Embryonic stem cell test in vitro based on the characteristic of embryonic stem cell can evaluate the potential embryotoxicity and teratogenicity of EEDs.

[Key words]embryonic stem cell; environmental endocrine disruptors; embryotoxicity

[收稿日期]2016-02-05

doi:10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.02.001

[中圖分類號]R994.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-2344(2016)02-0065-03

[作者簡介]馬明月(1970—)，女(漢)，教授，博士，碩士生導師.研究方向：發育毒性與出生缺陷.E-mail：mymacmu@163.com

[基金項目]遼寧省教育廳一般項目(No.L2014414)；沈陽市科技局項目(No.F14-158-9-22)；遼寧省大學生創業計劃項目(No.20141016400006)