區域動脈灌注5-FU誘導大鼠急性胰腺炎腺泡細胞凋亡及Caspase-3表達

葉樂馳，鄭春曉，金約朋，白永愉，李強，周蒙滔

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000，1.腫瘤外科；2.肝膽外科）

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區域動脈灌注5-FU誘導大鼠急性胰腺炎腺泡細胞凋亡及Caspase-3表達

葉樂馳1，鄭春曉2，金約朋2，白永愉2，李強2，周蒙滔2

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000，1.腫瘤外科；2.肝膽外科）

［摘 要］目的 探討區域動脈灌注（regional arterial infusion，RAI）5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）對大鼠急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）胰腺腺泡細胞凋亡的影響及其對急性胰腺炎的治療作用。方法 18只健康成年SD大鼠隨機分成3組：對照組（C組）、急性胰腺炎組（AP組）和5-FU治療組（5-FU組）。各組均行胃左動脈置管，AP組和5-FU組以大劑量雨蛙素（每小時腹腔注射50 μg/kg，連續6 h）誘導建立大鼠急性胰腺炎模型，對照組注射同等劑量的生理鹽水。5-FU組在第一次腹腔注射雨蛙素1 h后立即區域動脈灌注5-FU（40 mg/kg）治療，C組和AP組區域動脈灌注等量的生理鹽水。建模成功后3 h取標本并處死大鼠，檢測血淀粉酶濃度，RT-PCR法檢測胰腺組織內TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平，胰腺標本送病理學檢查，Western blotting法檢測胰腺組cleaved Caspase-3的蛋白表達，同時TUNEL法檢測大鼠胰腺腺泡細胞凋亡情況。結果 與AP組比較，5-FU組血淀粉酶濃度明顯降低（P＜0.05）；胰腺組織內TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平下降（P＜0.05）；胰腺組織病理學改變減輕；胰腺組織cleaved Caspase-3的蛋白表達增加；胰腺腺泡細胞凋亡增加（P＜0.05）。結論 區域動脈灌注5-FU對大鼠急性胰腺炎有改善作用，其作用機制可能與誘導胰腺腺泡細胞凋亡有關。

［關鍵詞］急性胰腺炎；凋亡；5-氟尿嘧啶；區域動脈灌注；雨蛙素；大鼠

盡管近年來針對急性胰腺炎（AP）的治療有所改進，但病死率高、并發癥多、治療費用高昂的治療現狀仍未見明顯改觀［1］。5-FU治療AP取得了肯定的療效［2-6］，但是缺乏深入的機制研究。本實驗通過建立雨蛙素誘導的大鼠AP模型，從胰腺腺泡細胞凋亡的角度去探討5-FU對AP的治療機制。

1　材料和方法

1.1材料和試劑

清潔級健康成年雄性SD大鼠，體重250～300 g，購于溫州醫科大學實驗動物中心。5-FU注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；雨蛙素（美國Sigma公司）；亞甲蘭染色液、HE染色劑（北京索萊寶科技有限公司）；戊巴比妥鈉（上海試劑總公司）；PE10導管（寧波安萊軟件與器械有限公司），大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6引物序列（上海生工合成）。

1.2動物分組與建模

雄性SD大鼠18只，術前禁食12 h，不禁水。常規1.5%戊巴比妥鈉針（1 mg/kg）腹部皮下注射麻醉。三組均麻醉后開腹，行胃左動脈置管［7］后引出體外固定，術后5 h清醒后誘導胰腺炎模型。（1）對照組（C組）：給予腹腔內注射等量的生理鹽水；（2）急性胰腺炎組（AP組）：依照Bhatia等［8］方法建立大鼠AP模型，大劑量雨蛙素（caerulein）50 μg/kg，每隔1 h腹腔注射，連續6 h，總計6次，誘導建立大鼠急性胰腺炎模型；（3）5-FU治療組（5-FU組）：同上雨蛙素制模，第1次雨蛙素皮下注射后1 h，行5-FU胃左動脈區域動脈灌注。5-FU動脈灌注劑量40 mg/kg，灌注速度6.0 mL/h。C組和AP組相同的時間給予胃左動脈灌注等量的生理鹽水。大鼠清醒后自由飲水，禁食。

1.3標本采集及指標檢測

各組建模完成后3 h，分別再次麻醉大鼠，抽血、取標本，檢測如下指標：（1）血清淀粉酶，采用日本Beckman Coulter全自動生化儀檢測；（2）RT-PCR法檢測胰腺組織內TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA表達水平。TNF-α上游引物序列5′-ACTGAACTTCGGGGTGATTGG-3′，下游引物序列5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′；IL-1β

1.4統計學分析

2　結果

2.1胰腺組織光鏡觀察

光鏡下，C組大鼠胰腺結構基本正常。AP組胰腺腺體結構紊亂，胰腺間質水腫，部分腺泡細胞空泡化，伴有大量炎癥細胞浸潤。5-FU組較AP組胰腺間質水腫、腺泡細胞空泡化、炎癥細胞浸潤均明顯減輕，圖1。

2.2胰腺組織病理學評分

AP組胰腺病理學評分最高，提示胰腺的損傷最嚴重。區域動脈灌注5-FU后，胰腺病理損傷程度減輕，病理學評分減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。5-FU組血清淀粉酶濃度較AP組有明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。具體見表1。

2.3胰腺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平

采用RT-PCR法檢測胰腺組織TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA表達水平。與C組比較，AP組和5-FU組胰腺組織內TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平均明顯的升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。5-FU組胰腺組上游引物序列5′-CACCTTCTTTTCCTTCATCTTTG-3′，下游引物序列5′-GTCGTTGCTTGTCTCTCCTTGTA-3′；IL-6上游引物序列5′-TGATGGATGCTTCCAAACTGGA-3′，下游引物序列5′-GAGCATTGGAAGTTGGGGTA-3′；內參為大鼠GAPDH。（3）取部分胰腺置于4%多聚甲醛溶液中固定用于HE染色。HE染色法觀察胰腺組織改變；（4）采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導dUTP缺口末端標記（TUNEL）法檢測細胞凋亡。凋亡指數（apoptotic index，AI）計算方法：取4個高倍鏡視野，每個視野中計算250個腺泡中凋亡細胞數，AI=（凋亡細胞總數/1 000）×100%；（5）Western blotting法檢測胰腺組織cleaved Caspase-3蛋白表達水平；（6）按照Schmidt標準［9］對胰腺進行病理評分，由有經驗的病理科醫師雙盲進行評分，根據胰腺間質水腫、腺泡細胞壞死、出血和脂肪壞死、炎癥細胞浸潤進行評分，每項按照嚴重程度分別評分為0～4分。織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平較AP組明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖1　大鼠胰腺組織光鏡觀察（HE，×200）

表1　各組胰腺病理學評分和血淀粉酶濃度

表2　各組胰腺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達水平

2.4胰腺腺泡細胞凋亡的改變

TUNEL法檢測胰腺腺泡細胞的凋亡，細胞核中深褐色的胰腺腺泡細胞為凋亡的細胞。各組的胰腺腺泡細胞凋亡指數（%）分別如下：C組（0.37±0.082）較少發生凋亡，凋亡指數低；AP組（1.12±0.26）凋亡指數較C組明顯增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；5-FU組（2.5±0.39）胰腺腺泡細胞凋亡較AP組明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.5胰腺組織Caspase-3蛋白表達的變化

采用Western blotting法檢測胰腺組織cleaved Caspase-3蛋白表達，結果如圖3所示。AP組中Caspase-3水平明顯高于C組，而5-FU組中Caspase-3水平較AP組明顯升高。該結果提示胃左動脈區域動脈灌注5-FU后Caspase-3表達增加。

圖2　大鼠胰腺TUNEL法顯示胰腺腺泡細胞的凋亡（TUNEL，×100）

圖3　胰腺組織Cleaved Caspase-3蛋白表達情況

3　討論

胰腺腺泡細胞病理損害的結果主要有凋亡和壞死兩種［10］。發生AP后，若胰腺腺泡壞死，細胞內多種胰酶成分被釋放，可導致胰腺局部強烈的炎癥反應進而激活全身炎癥系統，從而誘發全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory reaction syndrome，SIRS）。若胰腺腺泡細胞凋亡，由于細胞膜的完整性，使得腺泡細胞內的胰酶成分不外泄，則不伴有或僅有輕微的炎癥反應，引起的胰腺炎病變亦較輕，也不致發生SIRS。胰腺腺泡的損害方式（凋亡或壞死）決定了炎癥級聯反應的程度。壞死可促進炎癥細胞的聚集和激活，釋放炎癥介質，誘發“瀑布樣”的炎癥級聯反應，加重胰腺炎；凋亡有利于限制炎癥的過度激活［10］。因此，如果我們能夠誘導胰腺腺泡細胞發生凋亡，減少壞死，則有可能抑制炎癥反應的的啟動及其引發的SIRS。

自上世紀70年代5-FU就被用于治療AP［11-12］，療效肯定［2-6，13］。研究發現，5-FU以線粒體依賴和非依賴途徑誘導細胞凋亡均伴隨Caspase-3活化［14］，進而激活下游的酶和蛋白，引起細胞凋亡。與本實驗研究結果與此相一致，區域動脈灌注5-FU伴隨胰腺腺泡細胞Caspase-3的激活和胰腺腺泡的凋亡。

我們采用區域動脈灌注5-FU的方法作為誘導胰腺局部腺泡細胞凋亡的手段，除上述5-FU能誘導凋亡的原因之外，主要考慮區域動脈灌注途徑能大幅提高胰腺組織局部藥物濃度而不相應增加其全身毒副作用的優點［3］。Cao Y等［14］證實誘導胰腺腺泡細胞凋亡有利于減輕AP的嚴重程度。Orabi等［15］在大鼠胰腺炎模型中發現：腺泡細胞發生凋亡時胰腺炎相對較輕，認為凋亡可使胰腺腺泡細胞免除壞死，減低AP的嚴重性。由此看來，胰腺腺泡細胞的凋亡對AP病程進展是一種有益的反應。

本實驗結果顯示，區域動脈灌注5-FU可降低AP大鼠血淀粉酶濃度和胰腺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平，減輕胰腺病理損傷，說明通過區域動脈灌注5-FU對雨蛙素誘導的AP起到治療作用。區域動脈灌注5-FU使得胰腺腺泡細胞Caspase-3表達增加。區域動脈灌注5-FU使得胰腺腺泡細胞的凋亡增加。凋亡是細胞主動的死亡，是有基因控制的細胞程序性死亡。Caspase家族成員在凋亡的過程中起到了關鍵作用，其中Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，它在凋亡信號轉導的許多途徑中發揮功能［16-17］。結合我們的實驗結果，推測5-FU可能通過增加Caspase-3表達，誘導胰腺腺泡細胞凋亡增加，進而對AP起到治療作用。

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（本文編輯：張和，魯翠濤）

·論著 基礎研究·

Effect of 5-fluorouracil administered with regional arterial infusion on pancreatic acinar cell apoptosis and expression of Caspase-3 in rats with acute pancreatitis

YE Le-chi1， ZHENG Chunxiao2， JIN Yue-peng2， BAI Yong-yu2， LI qiang2， ZHOU Meng-tao2.1Department of Oncological Surgery；2Department of Hepatobiliary Surgery， The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325000， China

AbstractObjective To assess the effects of 5-fluorouracil （5-FU） administered with regional arterial infusion （RAI） on pancreatic acinar cell apoptosis of acute pancreatitis （AP） and its effect on AP in rats. Methods Eighteen male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into 3 groups: control group （C group）， acute pancreatitis group （AP group）， and the 5-FU treatment group （5-FU group）. A catheter was inserted through the left gastric artery in all the three groups. AP model was induced by hourly intraperitoneal injections of saline containing a supramaximally stimulating dose of caerulein （50 μg/kg） for 6 h. 5-FU （40 mg/kg） was administered with RAI to the 5-FU group following 1 h after the first intraperitoneal injection of caerulein. Saline was administered with the same doses to the other two groups. Serum amylase activity and mRNA levels of TNF-α， IL-1β，IL-6 in pancreatic tissues were measured with RT-PCR at 3 h following the induction of AP. The pathological changes in the pancreas tissues were observed and scored. Protein expression of cleaved Caspase-3 in pancreatic tissues was measured with Western blotting analysis. Apoptosis was quantified by TUNEL assay. Results Compared with the AP group， the serum amylase activity， the mRNA levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 in pancreatic tissues and the pathological scores of pancreas in the 5-FU group decreased significantly （P＜0.05）. Expression of cleaved Caspase-3 in pancreatic tissues and pancreatic acinar cell apoptosis in the 5-FU group increased sig-book=206,ebook=35nificantly than that in the AP group （P＜0.05）. Conclusion RAI with 5-FU has beneficial effects on AP rats， the underlying mechanism is possibly related to indue pancreatic acinar cell apoptosis.

Key wordsacute pancreatitis； apoptosis； 5-fluorouracil； regional arterial infusion； caerulein； rats

［通訊作者簡介］周蒙滔，主任醫師，博士生導師，E-mail：zmt0417@hotmail.com。

［第一作者簡介］葉樂馳（1979-），男，浙江溫州人，主治醫師，博士。

［基金項目］浙江省自然科學基金（LY12H03007）；國家自然科學基金（81370563）；浙江省醫藥衛生重大科技計劃（WKJ2012-2-033）；浙江省科技廳公益性應用項目（2012C23108））；溫州市科技局項目（H20110016）。

［收稿日期］2015-12-24

［中圖分類號］R576

［文獻標識碼］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.008