慢性移植腎病外周血Th17細(xì)胞及其因子變化的意義

陜西省人民醫(yī)院腎移植科(西安710068)

張蓬杰　張志明△　石斌婭　杜　鵬　 段　斌　陳　瑞　孫建國

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慢性移植腎病外周血Th17細(xì)胞及其因子變化的意義

陜西省人民醫(yī)院腎移植科(西安710068)

張蓬杰張志明△石斌婭杜鵬 段斌陳瑞孫建國

摘要目的：探討外周血CD4+Th17/CD4+T 比率及IL- 17、IL-6與IL-23在慢性移植腎腎病患者中的變化及意義。方法：使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢性移植腎腎病、移植腎功能正常以及未行腎移植的慢性腎功能不全尿毒癥期和健康人四組人群中Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子。結(jié)果：CAN患者組CD4+Th17/CD4+T比率為3.96±0.28%，血清IL-17、IL-6與IL-23分別為：273.12±17.62pg/ml， 231.52±45.32pg/ml，548.79±15.25 pg/ml；移植腎功正常組：CD4+Th17/CD4+T比率為2.47±0.25%，血清IL-17、IL-6與IL-23分別為142.32±10.15pg/ml，157.26±8.17pg/ml，251.20±13.28pg/ml；尿毒癥組：CD4+Th17/CD4+T比率為1.48±0.29%，血清IL-17、IL-6與IL-23分別為44.52±6.12 pg/ml，67.38±10.38pg/ml，35.43±9.32pg/ml；健康組：CD4+Th17/CD4+T比率為1.59±0.31，血清IL-17、IL-6與IL-23分別為36.87±8.14 pg/ml，60.28±8.72 pg/ml，38.15±8.56 pg/ml。 移植腎病組指標(biāo)明顯高于移植腎功能正常組(P<0.05)，接受移植組較未行移植組各指標(biāo)均明細(xì)升高(P<0.05)，而未移植尿毒癥組與健康組各指標(biāo)無明顯差別(P>0.05)。結(jié)論：移植后患者CD4+Th17/CD4+T比率及細(xì)胞因子表達(dá)均升高；CAN組較移植腎功能正常組外周血CD4+Th17/CD4+T比率及細(xì)胞因子表達(dá)升高更為明顯；未接受移植兩組間CD4+Th17/CD4+T比率及細(xì)胞因子變化不明顯。

主題詞腎移植腎病/血液白細(xì)胞介素17/代謝白細(xì)胞介素6/代謝

慢性移植腎腎病(Chronic allograft nephropathy，CAN)是指腎移植3個(gè)月后出現(xiàn)移植腎功能進(jìn)行性減退,常伴有高血壓、蛋白尿等[1]。早期進(jìn)行移植腎活檢即便已經(jīng)發(fā)現(xiàn)移植物進(jìn)入慢性腎病，但很難從病理演變判斷其發(fā)生的具體原因[2]。近年來研究表明：CD4+IL-17+輔助性T細(xì)胞( Th17細(xì)胞)及其細(xì)胞因子在機(jī)體調(diào)節(jié)免疫中起重要作用[3]。現(xiàn)就Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在CAN患者發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行探討。

資料與方法

1一般資料隨機(jī)選擇我科腎移植患者94例，其中慢性移植腎腎病組(CAN組)28例，為同種異體腎移植術(shù)后2年以上，血肌酐介于200～400μmol/L，未進(jìn)行透析治療的CAN患者；移植腎功能正常組(Normaltransplantation kidney，NTK) 35例，為同種異體腎移植術(shù)后2年以上、血肌酐正常；疾病對(duì)照組(CRF組) 31例，為慢性腎功能不全 (Chronic renal function,CRF)患者，血Cr為350～550μmol/L，也未行血液透析治療；另外選擇健康體檢者28例為健康對(duì)照組(Normal subjects,NC)。CAN組入選標(biāo)準(zhǔn)：①男、女不限，年齡18～55歲，原發(fā)病為慢性腎小球腎炎致慢性腎功能不全-尿毒癥期，術(shù)前受者無明顯感染及急慢性肝炎等；②HLA基因配型良好，HLA錯(cuò)配位點(diǎn)均在2個(gè)以內(nèi)；③受者術(shù)前術(shù)后治療基本相同，術(shù)后應(yīng)用甲基潑尼松龍治療，維持期治療應(yīng)用他克莫司(FK506)+麥考嗎替酚酸酯(MMF)+強(qiáng)的松(Pred)；④術(shù)后受者未出現(xiàn)過急性排斥反應(yīng)或嚴(yán)重感染等。 通過臨床和病理檢查相結(jié)合的方法明確診斷，并依據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)分組。

2CAN診斷標(biāo)準(zhǔn)CAN病例按照臨床及病理相結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。①臨床標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后3個(gè)月出現(xiàn)高血壓，B超檢查排除血管性因素，尿蛋白陽性，并逐漸增多；化驗(yàn)血清肌酐及尿素氮升高，腎功能進(jìn)行性減退；除外其它造成移植腎功能下降的原因；移植腎B超檢查提示：移植腎實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，皮質(zhì)血流稀少，阻力指數(shù)略升高，移植腎體積縮小等。②病理標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)移植腎病理檢查的纖維化程度和Banff05標(biāo)準(zhǔn)對(duì)移植腎病理標(biāo)本進(jìn)行分期，Banff I期以上診斷為CAN。

3檢測(cè)方法

3.1四組患者晨起空腹分別取靜脈血約4ml，置于肝素鈉抗凝真空采血管中，充分混勻，常溫下保存，一部分離心后取血清保存于-20℃低溫冰箱中備用，供ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-17、IL-6、IL-23；另一部分在2 h內(nèi)提取外周血單個(gè)核細(xì)胞( PBMC)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血中CD4+IL-17+輔助性T細(xì)胞。

3.2CD4-PC5抗體、PE-IL-17A抗體及相應(yīng)的對(duì)照抗體APC-IgG1、核內(nèi)染色用固定破膜劑購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。PMA、離子霉素、莫能霉素、人淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma公司。人IL-17、IL-6、IL-23 試劑盒購自上海武昊經(jīng)貿(mào)有限公司。

3.3標(biāo)本的收集與處理：收集清晨空腹靜脈血4ml肝素抗凝，一部分800r/min離心10 min后取血清凍存于-20℃冰箱以檢測(cè)IL-17、IL-6、IL-23。另一部分應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液處理后行外周血CD4+T淋巴細(xì)胞分離：上述抗凝血Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞( PBMC )，操作按試劑盒說明進(jìn)行, 應(yīng)用免疫磁珠法分離外周血CD4+T淋巴細(xì)胞, 錐蟲藍(lán)染色判定細(xì)胞活力> 95%, 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度> 97%。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞：取PBMC懸液接種于24孔板，每孔接種1ml，加入刺激劑PMA20ng/ml，離子霉素1μg/ml，莫能霉素10μl/ml，370C，5%CO2，孵育4h。收集細(xì)胞后調(diào)整濃度為1×107/ml。取PBMC懸液100ul加入CD4-PC5抗體，陰性對(duì)照管加入Ig G1-PC5抗體，室溫避光孵育30min，PBS洗滌1次。然后加入固定劑4%多聚甲醛避光靜置5min。之后加入破膜劑0.5ml，室溫避光10min，PBS洗滌1次后棄上清。加入胞內(nèi)抗體IL-17-PE，對(duì)照管加入同型對(duì)照，4℃避光染色30min。PBS洗滌2次后在CXP軟件下獲取1萬個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用Becman Coulter FC 500流式細(xì)胞儀分析。

3.5血清IL-17、IL-6、IL-23檢測(cè)應(yīng)用雙抗體夾心(ELISA)法，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究應(yīng)用SPSS10.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用單因素方差分析(One-Way Anova)，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

結(jié)果

1患者一般情況比較隨機(jī)選擇的4組患者及體檢者在樣本量大小、性別分布、年齡分布、原發(fā)病種類無顯著性差異(P>0.05)，CAN組和NTK組在移植時(shí)HLA位點(diǎn)錯(cuò)配率無顯著性差異(P>0.05)，術(shù)后應(yīng)用免疫抑制誘導(dǎo)藥物一致，免疫抑制維持治療為同一藥物濃度的他克莫司。

2四組CD4+Th17/CD4+T淋巴細(xì)胞比率比較見附表。腎移植手術(shù)后，無論移植腎功能是否正常，CD4+Th17/CD4+比率較未行腎移植者均明顯升高(P<0.05)。對(duì)于腎移植受者，發(fā)生慢性移植腎腎病的受者其比率較移植腎功正常者升高更為明顯(P<0.05)；而對(duì)于未行腎移植患者，尿毒癥患者的CD4+Th17/CD4+比率與正常對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)，提示CD4+Th17/CD4+比率的變化與尿毒癥狀態(tài)關(guān)系不大。

3各組IL-6、IL-23、IL-17細(xì)胞因子比較見附表。CAN組較NTK組細(xì)胞因子水平明顯升高(P<0.05)；且移植兩組較未移植組細(xì)胞因子水平也明顯升高(P<0.05)；未移植組間細(xì)胞因子水平變化無顯著性差異(P>0.05)。提示尿毒癥狀態(tài)對(duì)Th17細(xì)胞因子變化影響不大。

附表　四組間CD4+IL-17/CD4+細(xì)胞比率及相關(guān)細(xì)胞因子在外周血中的比較±s)

注：CAN組與NC組比較,P<0.05；與CRF組比較,P<0.05；與NTK組比較, P<0.05

討論

腎移植手術(shù)做為尿毒癥患者的最佳治療方法，移植后早期腎功能已顯著改善，患者生活質(zhì)量明顯提高，但遠(yuǎn)期效果并不理想，移植腎的平均壽期仍徘徊在10年左右，最終大多患者將再次面臨血液透析來維持生命，導(dǎo)致移植腎失去功能的主要原因是CAN[4]。常見原因主要有免疫和非免疫因素，免疫因素包括術(shù)后的急、慢性排斥反應(yīng)及發(fā)生頻率、病理類型、嚴(yán)重程度、HLA配型等；非免疫因素包括鈣調(diào)神經(jīng)蛋白阻滯劑(CNI)腎毒性、反復(fù)病毒感染、術(shù)后血糖異常、高血壓病、脂代謝異常等影響[5]。同時(shí)供、受者性別不同、年齡差距、體重差異和供腎摘取方式以及冷、熱缺血時(shí)間的長短、術(shù)后早期是否發(fā)生急性腎小管壞死都與CAN 的發(fā)生有關(guān)。移植腎穿刺病理檢查表現(xiàn)為：腎動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、管腔阻塞、缺血性腎小球改變、移植腎小球病、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化和間質(zhì)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤等改變[2]。但這些病理改變都是非特異性的，單純從病理變化很難判斷其發(fā)生的具體原因。由于沒有特異性的免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，大多數(shù)病人在移植腎功能已經(jīng)損害嚴(yán)重，出現(xiàn)大量蛋白尿或血清肌酐明顯升高時(shí)才會(huì)進(jìn)行診斷，而此時(shí)，即便給以相關(guān)治療移植腎功能大多難以恢復(fù)[6,7]。那么，我們能否找到一個(gè)CAN發(fā)生早期的免疫學(xué)指標(biāo)呢？

Th17細(xì)胞是近年新定義的一類CD4+T細(xì)胞亞群[8,9]。是初始CD4+T細(xì)胞活化后在TGF-β和IL-6的作用下分化生成，并通過分泌IL-17來誘導(dǎo)多種前炎性細(xì)胞因子(IL-17、IL-23、IL-6)和趨化因子[10,11]的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子能夠募集及活化中性粒細(xì)胞，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，抑制免疫耐受的產(chǎn)生，在自身免疫性疾病、腫瘤及感染等疾病中發(fā)揮重要作用[12]。Th17細(xì)胞能產(chǎn)生多種效應(yīng)因子，其中最重要的效應(yīng)因子是IL-17[13]，其受體在體內(nèi)表達(dá)廣泛。IL-17具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子(如IL-6、TNF)、趨化因子(如MCP1和MIP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，引起組織細(xì)胞浸潤和破壞[12]。IL-17與IL-23具有協(xié)同作用，可以增強(qiáng)炎癥反應(yīng)并造成組織炎性損傷。Th17細(xì)胞已被證實(shí)與自身免疫性疾病關(guān)系密切[14]。在多種自身免疫性疾病，如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、以及哮喘等患者的血清及組織中IL-17高表達(dá)[15～17]。 CD4+IL-17輔助性T細(xì)胞及其相關(guān)因子的變化在其它系統(tǒng)疾病中研究相對(duì)較多，且結(jié)論明確。但對(duì)于慢性移植腎腎病的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道，國外文獻(xiàn)資料也相對(duì)較少。本研究就Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在CAN患者發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行探討，意在尋求CAN早期的免疫學(xué)指標(biāo)，為早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防CAN的發(fā)生提供依據(jù)，從而為腎移植受者的長期存活提供有效的幫助。

該研究通過流式細(xì)胞技術(shù)和ELISA方法監(jiān)測(cè)CAN患者外周血中CD4+IL-17+輔助性T細(xì)胞和其相關(guān)因子的變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)歷腎移植后，無論移植腎功正常與否，CD4+IL-17/CD4+比率均較未行腎移植患者明顯升高。對(duì)于腎移植受者，發(fā)生慢性移植腎腎病后其比率較移植腎功正常者升高更為明顯。對(duì)于未行腎移植者，尿毒癥患者的CD4+IL-17/CD4+比率與正常對(duì)照組無明顯差異，表明CD4+Th17變化與尿毒癥狀態(tài)無關(guān)。細(xì)胞因子IL-6、IL-23、IL-17各組間的比較結(jié)果與上述變化相近，即：經(jīng)歷腎移植后，CAN組較NTK組細(xì)胞因子水平明顯升高。且移植兩組較未移植組細(xì)胞因子水平也明顯升高。未移植組間細(xì)胞因子水平變化無顯著性差異。對(duì)于CD4+Th17/CD4+比率及細(xì)胞因子IL-6、IL-23、IL-17在四組患者中的變化可以推斷：患者經(jīng)歷腎移植后，不管移植腎功能如何，均出現(xiàn)了Th17細(xì)胞和相關(guān)因子的增加，考慮與置入同種異體腎臟有關(guān)，外源性抗原刺激機(jī)體，產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，促進(jìn)了Th17細(xì)胞的產(chǎn)生活化，并分泌相關(guān)細(xì)胞因子。不過，CAN組較NTK組升高更明顯，說明存在其它因素導(dǎo)致Th17細(xì)胞增生及相關(guān)因子分泌更為明顯，這些因素不但包括了免疫學(xué)因素，還包括了非免疫學(xué)因素的影響，非免疫學(xué)因素對(duì)Th17的影響機(jī)制我們?nèi)圆幻鞔_。由此可見，CAN的發(fā)生并非一個(gè)獨(dú)立因素，而是一個(gè)復(fù)雜的過程。再之，是否可以將CD4+Th17/CD4+比率及細(xì)胞因子的變化做為CAN診斷的依據(jù)？升高到多少才能作為診斷為慢性移植物腎病的閾值，目前無法確定，因?yàn)楸敬窝芯坎±枯^少，還需要進(jìn)一步大樣本研究。

結(jié)合本研究初步發(fā)現(xiàn)：接受腎移植后患者外周血中CD4+IL-17細(xì)胞數(shù)量增加、細(xì)胞因子表達(dá)增加；發(fā)生慢性移植腎病后CD4+IL-17細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)增加且更為明顯，提示Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在CAN的發(fā)生中具有一定意義。但外周血Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子做為慢性移植物腎病的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)尚需更多的工作。

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(收稿：2015-06-20)

Changes of peripheral blood CD4+helper T cells and the related cytokines expression at the chronic allograft nephropathy

Department of Kidney Transplantation, Shaanxi Provincial People,s Hospital

(Xi，an 710068)Zhang PengjieZhang ZhimingShi Binyaet al

ABSTRACTObjective： To investigate the changes of CD4+helper T cells (Th17cells) and the related cytokines expression in the peripheral blood at the chronic allograft nephropathy (CAN) after kidney transplantation. Methods ：Thirty patients with CAN were examined for CD4+Th17/CD4+T ratio in the peripheral blood using the flow cytometry,IL-17,IL-6 and IL-23 levels in plasma of these subjects were measured by enzyme- linked mimunoadsorbent assay. and the data were compared with those of thirty-five kidney recipients with normal graft function, thirty-three patients with chronic renal function (CRF), and twenty-five normal subjects. All the recipients had no more than 2 HLA mismatch and received the same inductive and maintenance drug treatment. Results： The recipients with CAN had significantly higher CD4+Th17/CD4+T ratio and the related cytokines IL-17,IL-6 and IL-23 expression compared with those with normal graft function (3.96±0.28 vs 2.47±0.25 and 273.12±17.62 vs 142.32±10.15, 231.52±45.32 vs 157.26±8.17, 548.79±15.25 vs 251.20±13.28, P<0.05). The recipients whatever they had normal renal graft function showed significant difference in CD4+Th17/CD4+T ratio and the related cytokines IL-17,IL-6 and IL-23 expression from the patients with CRF (1.48±0.29 and 44.52±6.12 67.38±10.38 35.43±9.32) and the normal control subjects(1.59±0.31 and 36.87±8.14 60.28±8.72 38.15±8.56). The patiengts with CRF had no difference in CD4+Th17/CD4+T ratio and the related cytokines from the normal control subjects. Conclusion：The peripheral blood CD4+Th17/CD4+T ratio and the related cytokines IL-17、IL-6 and IL-23 expression in the kidney recipients with CAN are significantly higher than those of recipients with normal renal graft function, which does correlate with elevated creatinine level, suggesting a role of Th17and the related cytokines in the occurrence and development of CAN.

KEY WORDSKidney transplantationNephrosis/bloodInterleukin-17/metabolism Interleukin-6/metabolism

【中圖分類號(hào)】R692

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.01.042

△ 西安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科