減阻劑改善自發(fā)性高血壓大鼠左心室重塑

陳海濱　張新祿　梁鴻彬　劉雪薇　修建成

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院心內科，廣東　廣州　510515)

?

·基礎研究·

減阻劑改善自發(fā)性高血壓大鼠左心室重塑

陳海濱張新祿梁鴻彬劉雪薇修建成

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院心內科，廣東廣州510515)

〔摘要〕目的探討靜脈應用減阻劑(DRP)對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左心室重塑的影響。方法24只8周齡雄性SHR隨機分為3組：生理鹽水組(SHR+NS)，減阻劑濃度10 ppm組(SHR+10)和減阻劑濃度20 ppm組(SHR+20)，隔日予靜脈注射DRP 或NS,8只年齡匹配的雄性Wistar(WR+NS)大鼠作為對照組予靜脈注射NS。靜脈給藥60 d后，超聲心動圖評估四組大鼠心功能改變與左心室后壁厚度。分離大鼠左心室心肌，石蠟包埋，HE染色評估左心室心肌肥厚，masson染色評估心肌纖維化，免疫化學檢測左室心肌內皮素(ET)-1表達。結果超聲心動圖顯示4組大鼠左心室射血分數無統(tǒng)計學差異，SHR+10組和SHR+20組較SHR+NS組左室收縮末期后壁厚度顯著減小；SHR+20組較SHR+NS組左室舒張末期后壁厚度顯著減小。左心室心肌HE染色示SHR+20組心肌細胞橫截面積較SHR+NS組顯著減小。左心室心肌masson染色示SHR+10和SHR+20組較SHR+NS組心肌膠原纖維百分比顯著減少。左心室心肌免疫組化顯示，靜脈應用DRP后，SHR+10、SHR+20組左心室心肌ET-1蛋白表達較SHR+NS組顯著降低。結論靜脈應用DRP可改善SHR左心室重塑，其機制可能與DRP增加血液剪切應力抑制ET1表達有關。

〔關鍵詞〕減阻劑；心室重塑；內皮素-1；自發(fā)性高血壓大鼠

心臟重塑的定義為基因表達導致分子、細胞及間質改變，臨床表現為心肌肥厚、纖維化和心臟失代償。其中心室肥厚是高血壓患者死亡的獨立危險因素，逆轉心肌肥厚可以減少患者的心血管并發(fā)癥。內皮素(ET)-1主要由內皮細胞釋放，作用于分布于心臟、主動脈和腦血管平滑肌細胞的ETa受體,介導血管收縮、平滑肌細胞增生和心鈉素的分泌，參與細胞外基質合成過程。研究表明〔1〕高血壓患者內皮細胞釋放ET-1增加，血管及心臟ET-1基因表達上調，促進心肌肥厚與纖維化。提高血液流動剪切應力可以改變內皮細胞排列及結構，并可以抑制ET-1表達。減阻劑(DRP)可以顯著改變血液的流體動力學，提高血液流動的剪切應力〔2〕。本文觀察靜脈應用DRP對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左心室重塑的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑健康雄性SHR 24只,8周齡，體質量180～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。8只年齡性別匹配的Wistar大鼠，體質量180～220 g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2011-0015。大鼠均喂食標準飼料，飼養(yǎng)在南方醫(yī)院實驗動物中心恒溫、恒濕、人工光照明暗各12 h 的安靜飼養(yǎng)室內。DRP聚氧化乙烯(PEO)購于美國Sigma公司，蘇木精伊紅染色(HE)試劑盒及masson 染色試劑盒購于尚鴻生物科技有限公司，大鼠ET-1一抗購于英國Abcam公司。

1.2動物分組及干預SHR隨機分為三組：生理鹽水(NS)組(SHR+NS),DRP濃度10 ppm組(SHR+10)和DRP濃度20 ppm組(SHR+20)，8只年齡匹配的雄性Wistar(WR+NS)大鼠為對照組予靜脈注射NS。適應性喂養(yǎng)3 d后，隔日用微量泵于尾靜脈以3 ml/h速度輸注DRP或NS 30 min， 連續(xù)給藥60 d。

1.3減阻劑的制備精確稱取50 mg PEO加入25 ml NS，配制成濃度為2 000 ppm的溶液，將配好的PEO 溶液裝入分子截留量為50 000 D的透析袋中，于生理鹽水中透析24 h，用生理鹽水將透析后的溶液稀釋為10及20 ppm兩種濃度,最后采用孔徑0.2 μm 的濾膜過濾除菌后存放于4℃冰箱備用。

1.4超聲心動圖評估大鼠心功能改變與左室重塑靜脈給藥60 d后，實驗大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，將大鼠固定于實驗臺上后，給予左胸備皮，應用配備高分辨率系統(tǒng)的Sequoia512(Acuson,Siemens)超聲機，并使用17L5 probe( Acuson,USA)探頭，將超聲探頭定位于前胸產生最佳的胸骨旁短軸二維影像處，在乳頭肌水平記錄胸骨旁心臟短軸M型超聲圖像，每只大鼠重復2遍測量取平均值，記錄左室收縮末期直徑(LVESD)、左室舒張末期直徑(LVEDD)、左室收縮末期后壁厚度(LVPWS)和左室舒張末期后壁厚度(LVPWD),計算大鼠左室縮短分數(LVFS)〔LVFS = (LVEDD-LVESD)/LVEDD × 100%〕及大鼠左室射血分數(LVEF)〔LVEF=(左室舒張末期容積-左室收縮末期容積)/ 左室舒張末期容積× 100%〕。

1.5左心室心肌病理切片及免疫組織化學染色每組隨機取4只大鼠分離左心室心肌，放入4℃冰箱中預冷的NS中漂洗干凈血漬，于濾紙上輕壓吸水后，標記后投入10%中性甲醛溶液固定48 h，而后進行石蠟包埋，制成4 μm厚的切片，進行HE染色、masson染色及免疫組織化學實驗，中性樹膠封固。在OLYBAS顯微鏡下觀察采集各個切片放大400倍圖像數張，并用Image-Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件并測量。

1.6統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0軟件行單因素方差分析、Welch校正檢驗Bonferroni檢驗及DunnettT3檢驗。

2結果

2.1DRP可顯著改善SHR大鼠左室后壁肥厚超聲心動圖示SHR+10和SHR+20組較SHR+NS組LVESD〔(3.22±0.22)mm，(3.19±0.16)mm vs(2.33±0.13)mm,P<0.05〕、LVEDD〔(6.19±0.23)mm,(5.94±0.17)mm vs(5.38±0.17)mm,P<0.05〕顯著增加,LVPWS顯著降低〔(2.65±0.12)mm，(2.63 ±0.14)mm vs(3.31±0.21)mm,P<0.05〕；SHR+20組較SHR+NS組LVPWD〔(2.03±0.14)mm vs(2.58±0.048)mm,P<0.05〕顯著減低。SHR+10組〔(2.19±0.11)mm〕與SHR+NS組無明顯差異，WR+NS組LVESD〔(3.67±0.18)mm〕、LVEDD〔(6.75±0.19)mm〕、LVPWS〔(2.62±0.15)mm〕及LVPWD〔(1.91±0.11)mm〕與SHR+NS組均有明顯差異(P<0.05)，而WR組和SHR各組間LVFS〔WR+NS組(0.16±0.03)，SHR+NS組(0.56±0.03)，SHR+10組(0.48±0.03)，SHR+20組(0.46±0.03)〕及LVEF〔WR+NS組(0.76±0.03)，SHR+NS組(0.86±0.03)，SHR+10組(0.78±0.03)，SHR+20組(0.76±0.03)〕無差異(P>0.05)。見圖1。

2.2DRP可顯著改善SHR左心室心肌肥厚SHR+20組心肌細胞橫截面積較SHR+NS組明顯下降〔(291.72 ±29.08)μm2vs(630.97 ±54.15)μm2,P= 0.016〕。SHR+NS組較WR+NS組〔(309.34±9.91)μm2〕心肌細胞橫截面積顯著增加，而SHR+10組和SHR+20組與WR+NS組心肌細胞橫截面積無統(tǒng)計學差異。見圖2。

圖1　超聲心動圖評估大鼠心功能及左心室室壁厚度

圖2　各組大鼠左心室心肌HE染色(×400)

2.3DRP可顯著SHR壓大鼠左室心肌纖維化心肌masson三色染色示SHR+10和SHR+20組較SHR+NS組心肌膠原纖維百分比顯著減少〔(2.70 ±0.34)%，(2.38 ±0.34)% vs(6.58 ±0.49)%,P< 0.05〕，其中SHR+20組較SHR+10組對心肌肥大的抑制效果更強，但兩組之間并沒有統(tǒng)計學差異。SHR+NS組較WR+NS組〔(1.86±0.37)%〕心肌膠原纖維百分比顯著增加(P<0.05)。而SHR+10和SHR+20組較WR+NS組心肌膠原纖維百分比無顯著差異。見圖3。

2.4DRP可顯著抑制SHR大鼠左心室心肌ET-1表達ET-1在4組大鼠左心室心肌均有表達，SHR大鼠左心室心肌表達明顯高于WR大鼠。經過靜脈應用DRP后，SHR+10組、SHR+20組左心室心肌ET-1表達較SHR+NS組顯著降低；SHR+20組較SHR+10組ET-1表達顯著減少。見圖4。

圖3　各組大鼠左心室心肌masson染色(DAB,×400)

圖4　各組大鼠左心室心肌ET-1表達(DAB，×400)

3討論

心肌細胞是參與心臟重塑過程中的主要細胞，其他的成分包括間質、成纖維細胞、膠原和冠狀動脈血管。臨床表現為左心室肥厚和心臟擴大，其相應的組織學改變主要為心肌細胞肥大和間質纖維化，其中左心室肥厚是高血壓的早期改變，隨著心肌肥大引起的肌纖維重構排列紊亂、心肌收縮功能障礙，必然進一步發(fā)展為心力衰竭。左心室肥厚是引起心力衰竭不斷加重的病理生理基礎，是導致患者心血管事件發(fā)生率顯著增加的獨立危險因素，與高血壓的預后密切相關。

高血壓是內皮損傷的始動因素之一，內皮功能紊亂又可促進高血壓的發(fā)生與進展。研究表明〔3〕，在高血壓狀態(tài)下，主要表現為內皮依賴性舒張功能減弱和(或)內皮依賴性收縮功能增強以及血管壁炎癥反應增強等。ET-1參與許多疾病,包括高血壓、動脈粥樣硬化或纖維化的病理過程〔4〕。高血壓患者內皮細胞釋放ET-1增加，血管及心臟ET-1基因表達上調，增加的ET-1又可進一步升高血壓，促進心肌肥厚與纖維化〔5～7〕。

近年來，國內外學者逐漸開展了DRP在醫(yī)學領域的應用研究，初步結果顯示，靜脈應用DRP后可顯著減低血流阻力，明顯增加組織器官微循環(huán)的血流灌注，對于缺血性心血管疾病、失血性休克、腦卒中、糖尿病等的治療有重要的潛在價值〔8～10〕。本實驗室前期研究證實，靜脈應用DRP后可顯著增加大鼠腹主動脈血流速度，而不影響?zhàn)ざ龋晒接嬎憧傻弥鲃用}內血液流動剪切應力顯著增加〔11〕。靜脈應用DRP后血流剪切應力增加,抑制ET-1表達減弱了ET-1對SHR心肌肥厚的刺激，ET-1通過調節(jié)膠原纖維合成及基質金屬蛋白酶(MMPs)/組織MMP活性刺激纖維化過程〔12〕，使SHR大鼠左心室心肌纖維化被顯著抑制。綜上所述，靜脈應用DRP通過增加血液流動的剪切應力抑制ET-1表達，顯著改善了左心室重塑，為DRP在心血管病治療上的應用提供理論依據。

4參考文獻

1Vozzi F,Bianchi F,Ahluwalia A,etal.Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors〔J〕.Biotechnol J,2014；9(1):146-54.

2Chen X,Zha D,Xiu J,etal.A new hydrodynamic approach by infusion of drag-reducing polymers to improve left ventricular function in rats with myocardial infarction〔J〕.Int J Cardiol,2011；147(1):112-7.

3Topper JN,Gimbrone MJ.Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype〔J〕.Mol Med Today,1999；5(1):40-6.

4Spieker LE,Noll G,Ruschitzka FT,etal.Endothelin receptor antagonists in congestive heart failure: a new therapeutic principle for the future〔J〕?J Am Coll Cardiol,2001；37(6):1493-505.

5Harker KS,Jivan E,Mcwhorter FY,etal.Shear forces enhance Toxoplasma gondii tachyzoite motility on vascular endothelium〔J〕.Mbio,2014；5(2):379-82.

6Khalil RA.Modulators of the vascular endothelin receptor in blood pressure regulation and hypertension〔J〕.Curr Mol Pharmacol,2011；4(3):176-86.

7Ando J,Yamamoto K.Vascular mechanobiology: endothelial cell responses to fluid shear stress〔J〕.Circ J,2009；73(11):1983-92.

8Macias CA,Kameneva MV,Tenhunen JJ,etal.Survival in a rat model of lethal hemorrhagic shock is prolonged following resuscitation with a small volume of a solution containing a drag-reducing polymer derived from aloe vera〔J〕.Shock,2004；22(2):151-6.

9Pacella JJ,Kameneva MV,Csikari M,etal.A novel hydrodynamic approach to the treatment of coronary artery disease〔J〕.Eur Heart J,2006；27(19):2362-9.

10Faruqui FI,Otten MD,Polimeni PI.Protection against atherogenesis with the polymer drag-reducing agent Separan AP-30〔J〕.Circulation,1987；75(3):627-35.

11李小紅，郭鳳霞，楊沁，等.自噬干預對低剪切應力下血管內皮細胞eNOS和ET-1表達的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志,2014；22(9):875-80.

12Fraccarollo D,Bauersachs J,Kellner M,etal.Cardioprotection by long-term ET(A) receptor blockade and ACE inhibition in rats with congestive heart failure: monoversus combination therapy〔J〕.Cardiovasc Res,2002；54(1):85-94.

〔2015-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)

Drag-reducing polymers improving left ventricular remodeling in spontaneous hypertensive rats

CHEN Hai-Bin,ZHANG Xin-Lu,LIANG Hong-Bin,et al.

Department of Cardiology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of drag-reducing polymers (DRP) on the hypertension-induced left ventricular remodeling in spontaneous hypertensive rats (SHR).Methods24 male SHR were randomly divided into three groups,8 male,age matched Wistar rats (WR) were selected as control.SHR received intravenous injection of normal saline (SHR+NS),DRP of 10 ppm (SHR+10) and DRP of 20 ppm (SHR+20),respectively.WR in the control group only received equal-volume of normal saline (WR+NS).After 60 days,echocardiography was used to evaluate cardiac function and left ventricular remodeling in SHR.The cross-sectional areas of cardiomyocytes and collagen volume fraction in left ventricle were quantified from each group.The expression of endothelin (ET)-1 of left ventricle was examined by immunohistochemistry.ResultsCompared with the SHR+NS group,left ventricular end-systolic posterior wall thickness (LVPWS) was decreased in SHR+10 and SHR+20 group.Left ventricular end-diastolic posterior wall thickness (LVPWD) in SHR+20 was attenuated compared with SHR+NS group.The cross sectional areas of left ventricular cardiomyocytes in SHR+20 were attenuated compared with SHR+NS.The collagen volume fraction in left ventricle of SHR+10 and SHR+20 were decreased compared with SHR+NS.The expression of ET-1 in left ventricle of SHR+10 and SHR+20 were significantly attenuated compared with SHR+NS after DRP administration.ConclusionsChronic treatment with DRP can protect against left ventricular remodeling in SHRs.

【Key words】Drag reducing polymers；Left ventricular remodeling；Endothelin-1；Spontaneous hypertensive rats

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81470598)

通訊作者：修建成(1974-)，男，博士，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，主要從事冠心病的臨床與基礎研究。

〔中圖分類號〕R541.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2049-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.001

第一作者：陳海濱(1989-)，男，碩士，主要從事冠心病的臨床與基礎研究。