穴位埋線聯合鹽酸甲氯芬酯對血管性癡呆大鼠海馬CA1區幾種重要蛋白質表達的影響

楊　瓊　戴桃李　陳　粲　潘　婭

(貴州民族大學民族醫藥學院，貴州　貴陽　550025)

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穴位埋線聯合鹽酸甲氯芬酯對血管性癡呆大鼠海馬CA1區幾種重要蛋白質表達的影響

楊瓊戴桃李1陳粲2潘婭2

(貴州民族大學民族醫藥學院，貴州貴陽550025)

〔摘要〕目的探討穴位埋線與鹽酸甲氯芬酯聯合治療血管性癡呆(VD)大鼠的神經生化機制。方法改良四血管阻斷法建立VD大鼠模型；造模后分3個治療組，分別為鹽酸甲氯芬酯治療組、“腎俞” 、“足三里”穴位埋線治療組(埋線組)及鹽酸甲氯芬酯聯合穴位埋線組(聯合組)；免疫組織化學SABC法檢測并比較各組大鼠海馬CA1區內三種重要蛋白質的表達情況：膽堿乙酰轉移酶(ChAT)、腦源性神經營養因子(BDNF)及半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)。結果經聯合治療后，大鼠海馬CA1區ChAT、BDNF免疫反應陽性神經元數目明顯增多，Caspase-3陽性神經元數目明顯減少，各項指標與單獨治療組相比，差異明顯(P<0.05，P<0.01)。結論鹽酸甲氯芬酯聯合穴位埋線治療法，對VD大鼠海馬膽堿能神經元具有良好的保護作用，這可能與其上調海馬BDNF及下調Caspase-3密切相關。

〔關鍵詞〕鹽酸甲氯芬酯；穴位埋線；血管性癡呆；膽堿乙酰轉移酶；腦源性神經營養因子；半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶

目前血管性癡呆(VD)尚無特效治療方法。鹽酸甲氯芬酯是中樞興奮藥，臨床上主要用于腦外傷昏迷、腦卒中、小兒遺尿、精神錯亂等的治療，這與其具有抗缺血、缺氧等作用有關〔1〕。中醫療法具有操作簡單、無毒副作用、標本兼治的優勢〔2〕。本研究采用鹽酸甲氯芬酯聯合“腎俞”、“足三里”穴位埋線方法進行治療，并檢測VD大鼠腦內與學習記憶功能密切相關的腦區——海馬處膽堿乙酰轉移酶(ChAT)、腦源性神經營養因子(BDNF)及半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)三種重要蛋白質的表達水平，探討鹽酸甲氯芬酯聯合“腎俞”、“足三里”穴位埋線聯合應用對VD模型大鼠的影響及其機制。

1材料與方法

1.1動物及試劑5～6月齡健康雄性SD大鼠75只，體重280～300 g，清潔級，由貴陽醫學院動物中心提供。鹽酸甲氯芬酯膠囊(廣東先強藥業有限公司)。ChAT 試劑盒、BDNF試劑盒、Caspase-3試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型制備大鼠隨機平均分五組：假手術組、模型組、鹽酸甲氯芬酯治療組(甲氯芬酯組)、“腎俞”、“足三里”穴位埋線治療組(埋線組)、鹽酸甲氯芬酯及穴位埋線聯合治療組(聯合組)。采用改良Pulsinelli四血管阻斷 (4-VO) 法建立VD大鼠模型：模型組和治療組大鼠經10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉后，行背側頸正中切口，暴露雙側第一頸椎橫突翼小孔，用電凝針燒灼雙側翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞；再將大鼠行腹側頸正中切口，分離雙側頸總動脈，穿線備用；24 h后用動脈夾夾閉雙側頸總動脈，5 min×3次，每次間隔1 h。假手術組處理步驟同上，但不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉。模型制作成功檢驗：大鼠在4條血管阻斷后，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。不符合標準者剔除。

1.2.2治療方法甲氯芬酯組和聯合組用鹽酸甲氯芬酯(100 mg·kg-1·d-1)溶于2 ml水中灌胃；假手術組、模型組和埋線組給予相同體積的蒸餾水灌胃。同時埋線組和聯合組按照圖譜定位〔3〕，在雙側“腎俞”穴、“足三里”穴常規消毒后，用8號注射針頭埋入0.5 cm長的(4～0)醫用羊腸線。整個治療連續4 w。未滿4 w中途死亡者被剔除。

1.2.3免疫組化染色麻醉大鼠，自左心室插管灌注生理鹽水和10%中性甲醛以固定鼠腦，經脫水、透明、石蠟包埋處理后，行鼠腦海馬冠狀位切片，片厚4～5 μm。每只大鼠每個指標切5張片。免疫組織化學SABC法檢測海馬CA1區ChAT、BDNF、Caspase-3的表達，操作嚴格按照說明書進行。每張切片取5個視野，每個視野采集一幅圖像，計數ChAT、 BDNF、Caspase-3免疫反應陽性細胞數，取其平均值作為最后結果。

1.3統計學處理應用SPSS15.0軟件進行單因素方差分析及S-N-K檢驗。

2結果

2.1海馬CA1區ChAT的表達ChAT免疫反應陽性細胞在鏡下可見胞質有棕黃色陽性物質。假手術組海馬CA1區有大量ChAT陽性神經細胞分布，且胞質內有大量棕黃色陽性物質。模型組海馬CA1區細胞嚴重脫失，細胞結構模糊，胞體固縮，染色較淡，ChAT陽性神經細胞數較假手術組明顯減少(P<0.01)。3個治療組陽性細胞數較模型組增多、細胞排列較規則，固縮細胞明顯減少，ChAT陽性神經元均顯著增多，其中以聯合組的水平最高(P<0.01)。見表1。

2.2海馬CA1區BDNF的表達假手術組海馬CA1區有少量BDNF陽性細胞，免疫陽性顆粒主要分布在胞質和細胞膜表面。模型組海馬CA1區BDNF陽性細胞數目較對照組明顯增多(P<0.01)，胞質內棕黃色陽性顆粒密集深染。3個治療組免疫反應陽性神經元數均較模型組顯著增多，其中以聯合組的水平最高(P<0.05)。見表1。

2.3海馬CA1區Caspase-3的表達假手術組海馬CA1區有極少量Caspase-3陽性細胞，其胞質內有棕黃色陽性物質。模型組海馬細胞脫失，但Caspase-3陽性細胞數量增加，胞質內棕黃色物質增多，與假手術組比較差異顯著(P<0.01)。3個治療組Caspase-3陽性細胞數減少，其中以聯合組的水平最低，與模型組比差異顯著(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠海馬CA1區ChAT、BDNF及Caspase-3陽性

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05，與聯合組比較：4)P<0.01，5)P<0.01

3討論

腦反復缺血再灌注損傷和長期慢性低灌流是VD的主要發病原因〔4〕。實驗采用國際公認的改良Pulsinelli 4-VO法，永久性灼斷椎動脈并可逆性阻斷頸總動脈血流，使大鼠腦處于長期低灌流狀態，致腦功能嚴重受損，制備出近似人類臨床發病特點的VD大鼠模型〔5〕。

中醫將VD歸屬于“中風”、“呆病”、“善忘”的范疇，認為腎虛髓空是VD的根本，心腎不足、肝腎脾虛、氣血虧虛，則腦髓不足、神明失養而致癡呆〔6〕。“腎為先天之本，腎生髓”，“腎俞”穴有益精血、補腦髓，暢活氣血的作用〔6,7〕；“足三里”穴屬足陽明胃經，為氣血生化之源〔7〕。穴位埋線法是在祖國傳統針刺法思路上發展的另一技術。腸線作為一種異質蛋白，埋入穴位后有持久、柔和的穴位刺激優勢；同時羊腸線逐漸被機體吸收，能調節機體內環境的相對平衡，改善病灶部位血液循環，增加大腦營養供應〔8〕。

海馬作為邊緣系統的組成部分，是學習記憶的重要解剖基礎和神經中樞。記憶突觸就是膽堿能突觸，是學習記憶的結構和生理基礎〔9〕。海馬對缺血缺氧極為敏感。當膽堿能神經元受損時，腦內學習記憶的神經生物學基礎—海馬環路就會受損，導致癡呆發生。乙酰膽堿是迄今發現與學習記憶關系極為密切的一種神經遞質〔10〕。 ChAT常作為研究膽堿能神經元的標志或評估乙酰膽堿含量的間接指標〔11〕。本實驗結果提示此方法具有良好的保護缺血缺氧狀態下的海馬膽堿能神經元的作用。

BDNF是神經營養家族重要成員之一，廣泛分布于神經系統。它在胚胎生長發育過程中水平較高，隨著機體發育成熟其水平逐漸降低，在缺血缺氧的情況下反應性增高，與腦缺血損傷的保護有關〔12〕，其高表達不僅能提高神經元抵抗缺血損傷的能力，還能促進受損神經元的修復，并調節神經結構的重建。本文結果表明BDNF表達增加是局部腦組織對缺血損傷的反應，而這一反應可能也啟動了神經細胞修復機制；鹽酸甲氯芬酯聯合穴位埋線可以很好地加強這一保護機制，較單治療組明顯減輕了海馬神經元缺血損傷。

海馬結構中各功能亞區(CA1、CA2、CA3、CA4、齒狀回)神經元的丟失可能是血管性癡呆形成的病理學基礎，其中以CA1區大錐體細胞的丟失尤為重要〔13〕。而缺血缺氧所致的神經細胞丟失是以凋亡為主〔14〕。Caspase-3被認為是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，通常情況下Caspase酶原沒有活性，必須通過激活，才能誘導凋亡。當機體缺血缺氧時，凋亡發生機制被激活，所有的Caspase家族成員都被剪切，上游Caspase有序地激活下游，將凋亡信號傳至底物，而下游Caspase-3就是這個級聯反應的終末執行酶。它能降解多種胞內蛋白，導致胞體固縮，染色體蹦解，凋亡小體形成〔15〕而發生細胞凋亡。本文結果表明細胞凋亡反應受到抑制，缺血缺氧所致細胞損傷減少。

綜上所述，本課題采用中西醫相結合的方法對VD進行治療，觀察到大鼠海馬部位ChAT表達明顯增多，這可能恰與其上調BDNF水平及下調Caspase-平有關。即BDNF提高了神經元抵抗缺血損傷的能力，Caspase-3下調減少了腦細胞凋亡的程度，二者協同作用，使缺血缺氧狀態下神經元得到很好保護，降低了VD的腦損傷。

4參考文獻

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〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：貴陽市科技局基金資助(No.T2006-12)

〔中圖分類號〕R338.6

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2076-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.012

1暨南大學醫藥生物技術研究開發中心

2貴州醫科大學基礎醫學院生理學教研室

第一作者：楊瓊(1980-)，女，碩士，講師，主要從事神經生理學研究。