脂聯(lián)素在兔主動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的表達(dá)研究*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(西安710061)　王芝榮　舒　娟

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脂聯(lián)素在兔主動脈動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的表達(dá)研究*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(西安710061)王芝榮舒娟

摘要目的：探討脂聯(lián)素在兔動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的分布特點(diǎn)。方法：選擇動脈粥樣硬化新西蘭兔12只，對照組12只，處死每組動物后取出主動脈，觀察脂聯(lián)素在各組動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)。結(jié)果：動脈粥樣硬化兔血管壁脂聯(lián)素蛋白表達(dá)均顯著低于正常對照組(P<0.05)。結(jié)論：脂聯(lián)素蛋白在動脈粥樣硬化兔血管壁表達(dá)顯著減低，脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平上調(diào)可抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。

主題詞脈動硬化/診斷細(xì)胞因子類/代謝膽固醇/代謝胰島素抗體 動物，實驗兔@脂聯(lián)素

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種大、中型動脈血管的慢性非特異性炎癥病變,也是目前公認(rèn)為人群死亡的主要原因。脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)是一個與胰島素抵抗關(guān)系最緊密的特異性細(xì)胞因子，由脂肪組織所表達(dá)和分泌，其功能為抑制脂質(zhì)的聚集、使巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)吞噬減少、進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化[1]，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[2]。本研究擬探討兔動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)ANP表達(dá)的特點(diǎn)，為人類動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

1實驗動物及藥品選擇動脈粥樣硬化新西蘭兔12只，對照組12只，均為雄性，1月齡，體重1.4～1.7kg，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。脂聯(lián)素抗體(Anti-Adiponectin)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2標(biāo)本取材及留取用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)全身麻醉實驗動物后空氣栓塞處死動物，取出各組動物主動脈，去除血管外組織，生理鹽水沖洗后用中性甲醛液固定。

3免疫組化特異性染色免疫組織化學(xué)染色法觀察主動脈血管內(nèi)皮脂聯(lián)素表達(dá)水平。結(jié)果判定：血管壁脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)陽性結(jié)果為血管壁染成棕黃色，顯微鏡顯影系統(tǒng)采集圖像，選擇血管壁隨機(jī)取3個視野(×400)，計算機(jī)自動測量并計算陽性信號積分光密度(A值)。

4 Western blot檢測主動脈脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白總濃度及變性。以50ug/孔總蛋白上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，加入一抗(1∶250鼠抗兔ANP單克隆抗體或者1∶1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育過夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1∶1000稀釋)4℃孵育過夜。應(yīng)用凝膠掃描成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描分析，以β-actin作為內(nèi)參。

5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理所有數(shù)據(jù)，對滿足正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用t檢驗，用Pearson法行相關(guān)分析，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

結(jié)果

1兩組間AS斑塊面積比較動脈粥樣硬化組AS斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值為(38.35±4.33)%，顯著高于正常對照組(0．00±0.00)%，兩組有顯著性差異(P<0.05)。

2兩組間動脈壁脂聯(lián)素特異性染色陽性面積比較見圖1。動脈粥樣硬化組血管壁脂聯(lián)素蛋白表達(dá)為0.465±0.045，顯著低于正常對照組(0.643±0.073)，兩組有極顯著性差異(P<0.01)。

A 正常對照組　　　　　　 　　　　　　　　　 B動脈粥樣硬化組

3 Western blot檢測兩組間主動脈脂聯(lián)素蛋白的比較見圖2。經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化組血管壁脂聯(lián)素蛋白表達(dá)為0.765±0.085，顯著低于正常對照組(1.610±0.173)，兩組有顯著性差異(P<0.01)。

圖2　兩組間 Western blot檢測主動脈脂聯(lián)素蛋白的比較

4 脂聯(lián)素蛋白與動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值的相關(guān)性分析為了進(jìn)一步了解脂聯(lián)素蛋白與動脈粥樣硬化的關(guān)系，行脂聯(lián)素蛋白與動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值的相關(guān)分析，通過分析發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素蛋白與動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.573；P<0.001)。

討論

ANP是由脂肪細(xì)胞分泌的一種特異性蛋白質(zhì)，具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)胰島素抵抗的作用[3]。此外APN還可使內(nèi)皮細(xì)胞減少對白介素-8和組織因子等炎癥因子的表達(dá)[4]，降低內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞相互作用[5]，抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減少對氧化的低密度脂蛋白攝取，降低脂質(zhì)在泡沫細(xì)胞內(nèi)堆積[6]，從而保護(hù)血管結(jié)構(gòu)，抑制AS的發(fā)生、發(fā)展。以上研究清楚地描述了脂聯(lián)素延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，并闡明脂聯(lián)素與AS密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：動脈粥樣硬化組主動脈血管壁脂聯(lián)素蛋白表達(dá)顯著低于正常對照組，且脂聯(lián)素蛋白與動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值呈顯著負(fù)相關(guān)。即主動脈血管壁脂聯(lián)素蛋白表達(dá)陽性面積水平上調(diào)可在一定程度上延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。隨著對AS發(fā)病機(jī)制分子水平研究的不斷深入，有ANP在抗AS中的作用將成為新的研究熱點(diǎn)。

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(收稿：2015-08-20)

The expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Medicol College，

Xi’an Jiaotong University(Xi’an710061) Wang ZhirongShu Juan

ABSTRACTObjective：To investigate the expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits. Methods：12 atherosclerotic rabbits and 12 normal rabbits were sacrificed. Aortic atherosclerotic lesion area, intimal thickness and intimal / media thickness ratio were measured. Expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits were detected. Results： Protein expression of adiponectin in normal rabbits is greater than that in atherosclerotic rabbits (P<0.01).Conclusion：Accelerated levels of adiponectin can slow down the speed of atherosclerosis.

KEY WORDSArteriosclerosis/diagnosisCytokines/metabolismCholesterol/ metabolismInsulin antibodiesAnimals,laboratoryRabbits@ Adiponectin

【中圖分類號】R743.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.01.002

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2004K17-G22)