腦爾康對實驗性AD模型大鼠腦內興奮性氨基酸含量的影響*

侯吉星　權乾坤　李　璽△　西安市精神衛生中心(西安 710061)

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腦爾康對實驗性AD模型大鼠腦內興奮性氨基酸含量的影響*

侯吉星權乾坤▲李璽△▲西安市精神衛生中心(西安 710061)

摘要目的：觀察中藥腦爾康對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠膽堿乙酰轉移酶(ChaT)、興奮性氨基酸含量的影響及可能機制。方法：雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、多奈哌齊組、腦爾康組。采用大鼠雙側海馬一次性注射Aβ1-42制作AD模型，對照組注射等劑量生理鹽水。造模成功后第3天開始空白組和模型組給予生理鹽水ig(0.5mL·d-1)；多奈哌齊組及腦爾康組分別給予相應藥物ig (14.3 mL· d-1)，均每天一次。4周后，用Morris水迷宮法進行行為學測試，取材，免疫組化法觀察ChaT表達，高效液相色譜分析法測定各組大鼠海馬內興奮性氨基酸含量。結果：①與模型組比較，多奈哌齊組及腦爾康組大鼠腦內ChaT表達明顯增多(P<0.01)；②與模型組比較，多奈哌齊組及腦爾康組興奮性氨基酸水平有有明顯的下降(P<0.01)，且二者之間的結果無明顯差異。結論：腦爾康可能通過對ChaT表達的保護作用以及下調AD模型大鼠海馬內興奮性氨基酸含量解除興奮性氨基酸的毒性作用，達到防治AD的目的。

主題詞腦爾康阿爾茨海默病動物，實驗 大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，其發病機制仍未完全闡明。目前已經提出了膽堿能學說、谷氨酸能學說等假說。大量研究證明，興奮性氨基酸類神經遞質(excitatory amino acids，EAA)含量的改變與神經退行性病變、學習記憶的形成密切相關[1]。中藥腦爾康已在臨床應用多年，對老年癡呆患者有較好的改善作用。本次研究通過構建AD大鼠模型，應用腦爾康進行早期干預，通過觀察行為學、膽堿能系統有關的酶學變化以及興奮性氨基酸類神經遞質等多方面探討腦爾康抗癡呆的作用機制。

1材料

1.1動物健康雄性SD大鼠40只，體質量(260±10)g，西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號SCXH(陜)2011-004。試驗期間均以固體平衡飼料，自由飲水，在室溫(22±2)℃、濕度(50±5)%的條件下飼養。

1.2主要藥品與試劑中藥腦爾康為院內制劑(陜衛藥制劑注字920138)，全方由人參、黃芪、川芎、丹參、益智仁、生地、菖蒲、冰片組成，由西安交通大學醫學院第二附屬醫院中藥房提供，按傳統方法水煎，制成每毫升含生藥1 g·mL-1。抗ChaT抗體(武漢博士德生物工程有限公司產品，批號121015)；SABC免疫組化試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司產品，批號120913)；谷氨酸、天冬氨酸標準品(美國Sigma公司)；色譜純乙腈(德國MERCK公司)；鹽酸多奈哌齊片(衛材蘇州制藥有限公司，批號111013A)。

1.3主要儀器Morris水迷宮儀、數據自動采集機分析系統(中國醫學科學院動物所)；臺式離心機(上海夏普電器有限公司產品，型號：WP850A)；電動勻漿機(德國Heidolph公司，型號DIAX900)；高效液相色譜分析儀(日本島津公司，型號LC-10AD)；腦立體定位儀(日本太陽株式會社，型號SN-3)。

2方法

2.1動物AD模型制備選擇大鼠雙側海馬區一次性注射Aβ1-42制備AD模型[2]。將Aβ1-42溶于滅菌生理鹽水中，稀釋為10μg·μL-1，密封后置于37 ℃培養箱中孵育7 d，使其成為具有毒性的凝聚態，4 ℃ 冰箱保存備用。大鼠經10%水合氯醛(3.5mL·kg-1)腹腔注射麻醉，固定于大鼠立體定位儀，參照大鼠腦立體定位圖譜，用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器自硬腦膜垂直進針2.8 mm，每側海馬注射2μL Aβ1-42，緩慢注射5min，留針5 min，緩慢起針。空白組大鼠注射等體積生理鹽水。術后局部局部消毒后縫合頭皮，肌肉注射青霉素預防感染，連續3d。

2.2藥物干預造模成功后，大鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組、腦爾康組。依據劑量估換計算公式，多奈哌齊組、腦爾康組每天分別給予相應藥物ig(14.3g·kg-1·d-1)；空白組和模型組每天給生理鹽水ig(0.5 mL·d-1)，共28 d。

2.3行為學測試采用Morris水迷宮法檢測大鼠學習記憶成績[3]。

2.4免疫組化檢測ChaT表達水平完成行為學測試后，立即處死大鼠，取腦，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，石蠟切片機切片，切片厚度4μm，每張切片含皮層、海馬、齒狀回，每只小鼠取5張切片，4張進行免疫組化染色，一張HE染色。免疫組織化學法(SABC法)分別檢測各組大鼠海馬區乙酰膽堿轉移酶(ChaT)陽性表達情況。用Image pro plus圖像分析軟件測量ChaT的光密度(IOD)值。

2.5高效液相色譜分析法測定各組小鼠海馬內興奮性氨基酸含量大鼠腦組織樣品的處理：腦組織稱重,以1∶10 比例加入0.14 mol·L-1高氯酸,冰浴下充分勻漿,沉淀30 min,離心15 min,取上清液,加0.2mol·L-1KHCO3,混勻后于4℃離心5 min,取上清液,分裝,于- 70℃保存待測。對照品溶液的制備：精密稱取谷氨酸、天冬氨酸對照品10 mg，置于10mL容量瓶中，加0.5 mol·L-1碳酸氫鈉(ph=9.0)溶液1mL，加1% 2,4二硝基氟苯乙腈溶液1mL，置60℃水浴中加熱1 h。加乙腈稀釋至10mL，作為對照品溶液。供試品溶液的制備：取海馬組織，稱重，加入生理鹽水2mL勻漿，4000r離心10min，取上清液1mL，加入乙腈1mL沉淀，4000r離心10min，取上清液600uL置1.5 mLEP管中，加0.5mol·L-1碳酸氫鈉(ph=9.0)溶液300uL，1%2，4二硝基氟苯乙腈溶液300uL，置60℃水浴中加熱1h，作為供試品溶液。色譜條件：色譜柱：Kromasil C18柱。流動相：乙腈，醋酸鹽緩沖液(6%醋酸鈉水溶液：乙腈=70：30)。流速1mL·min-1，紫外檢測，檢測波長：360nm；柱溫：30℃。采用梯度洗脫法，梯度洗脫條件：0min～乙腈：緩沖鹽=0∶100；0-12min～乙腈：緩沖鹽=12∶88；12-14min～乙腈：緩沖鹽=20∶80；14-20min～乙腈：緩沖鹽=40∶60；20-30min～乙腈：緩沖鹽=60∶40；30-32min～乙腈：緩沖鹽=70∶30；32-37min～乙腈：緩沖鹽=0∶100；37-40min～乙腈：緩沖鹽=0∶100，分別取對照品、供試品10uL進樣、測定。

計算方法：外標法。

3結果

3.1腦爾康對AD模型大鼠ChaT表達的影響乙酰膽堿轉移酶ChaT免疫組化染色結果顯示：空白組大鼠皮層區、海馬CA1、CA3及齒狀回門區部位可見大量ChaT陽性神經元，免疫反應陽性產物較多，染色較深。①模型組在注射Aβ1-42后，海馬CA1、CA3及齒狀回門區ChaT免疫表達顯著下降，染色變淺，與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)。②與模型組比較，多奈哌齊組和腦爾康組海馬CA1、CA3及齒狀回門區ChaT免疫陽表達較模型組升高(P<0.01)，且二者之間無明顯差異(P >0.05)。

表1　腦爾康及對AD模型大鼠大腦皮層及海馬內ChaT免疫陽性表達的變化(IOD)

注：與空白組比較▲P<0.01；與模型組比較◆P<0.01

3.2腦爾康及對AD模型大鼠海馬內興奮性氨基酸含量的影響谷氨酸(glutamate，Glu)與天冬氨酸(aspartate，Asp)是腦組織內含量較高的兩種氨基酸，參與中樞神經系統的信息專遞，為中樞神經系統中重要的興奮性神經遞質。谷氨酸主要分布在大腦皮層、小腦、海馬及紋狀體；天冬氨酸則主要分布小腦、丘腦。用高效液相色譜法測定各組大鼠海馬內Glu和Asp，結果顯示：①模型組Glu和Asp含量高于空白族，有顯著性差異(P<0.01)；②與模型組比較，多奈哌齊組、腦爾康組Glu含量明顯減少(P<0.01)；且二組Glu含量無明顯差異(P>0.05)。

表2　腦爾康對AD模型大鼠海馬內興奮性氨基酸含量的影響

注：與空白組比較▲P<0.01；與模型組比較◆P<0.01

4討論膽堿能系統受損在AD發病機制中占用重要地位，各種原因引起的基底前腦膽堿能神經元損傷以及與此相關的皮層及海馬等腦區的膽堿能神經傳遞受損，在AD患者記憶及認知功能損傷過程中起重要作用。對大多數AD患者的腦研究顯示，在許多皮層區域ChaT活性與這些皮層區域老年斑的密度呈現不恒定的顯著負相關關系，本研究造模后，經水迷宮實驗確定的AD大鼠，發現海馬內神經元排列紊亂、不規則，部分神經元脫失；免疫組化染色顯示大腦皮層和海馬部位ChaT免疫陽性表達顯著降低。此病理改變符合對AD患者腦的病理檢查所見，較好地模擬了AD患者的特征性病變，是本實驗進行AD病因病機以及治療AD有效手段探索的重要依據。

在AD的發病機制中，谷氨酸能假說越來越受到重視。相關研究證實[4]Glu及其受體參與神經元信息傳遞，與學習記憶功能的形成密切相關，其作為神經樞及大腦皮質的補劑，主要存在于神經末梢谷氨酸囊泡內，對于興奮傳遞及神經細胞的保護都具有特殊的重要意義。我們的研究結果顯示，AD大鼠海馬組織的Glu和Asp含量顯著高于空白組，提示模型組大鼠腦內興奮性氨基酸代謝紊亂。與模型組比較，腦爾康組、多奈哌齊組Glu含量均顯著低于模型組，可見腦爾康可降低AD大鼠海馬內興奮性氨基酸含量，使AD大鼠海馬內興奮性氨基酸含量趨近于正常空白組。提示 AD 模型大鼠海馬區 Glu 大量釋放并堆積于突觸間隙，使谷氨酸受體過度興奮激活，從而引起一系列以神經細胞或其他組織細胞死亡為終結的病理生理變化，可能是Aβ1-42所致海馬神經元損傷造成學習記憶障礙的機制之一，腦爾康能夠在一定程度上降低Glu水平從而起到抗癡呆作用。

參考文獻

[1]CoyleJ,Puttfarcken P.Oxidative stress,glutamate and neurodegenerative disorders.Science 1993,262：689-694.

[2]E.Hare,D.T.Weldon,P.W.Mantyh,et al.Dalayed behavioral effects following intrahippocampal injection of aggregated a beta(1-42).Brain Research,1999,815(1):1-10.

[3]葉翠飛，張麗，艾厚喜，等．2種水迷宮實驗對擬癡呆模型動物學習記憶功能測試的比較[J]．中國行為醫學科學，2004,13(3)：252.

[4]呂高萍． 阿爾茨海默病中西醫早期診斷的研究進展[J]．中華中醫藥雜志，2012，08：2142．

(收稿2015-03-11；修回2015-04-19)

【中圖分類號】R749.16

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.01.064

*陜西省科技攻關計劃項目[2007K16-07(5)]

▲西安交通大學醫學院第二附屬醫院(西安710004)

△通訊作者