ATP清除劑三磷酸腺苷雙磷酸酶對實驗性矽肺的干預作用*

蘇程程，　向國安，　馬永強，　周　欣，　彭守春，　魏路清△，　姬文婕△

(1中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬平津醫院呼吸與重癥醫學科, 2天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室，天津 300162)

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ATP清除劑三磷酸腺苷雙磷酸酶對實驗性矽肺的干預作用*

蘇程程1▲，向國安1▲，馬永強2，周欣2，彭守春1，魏路清1△，姬文婕1△

(1中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬平津醫院呼吸與重癥醫學科,2天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室，天津 300162)

[摘要]目的： 觀察三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase，Apy)對實驗性矽肺小鼠肺纖維化的干預作用及可能機制。方法: 160只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為對照組、矽肺組、Apy組及溶劑組，采用經口咽吸入法給予SiO2懸濁液(50 mg/kg)建立小鼠實驗性矽肺模型，對照組給予等量生理鹽水。Apy組在造模的同時及造模后4 h采用經口咽吸入法給予Apy(40 mg/kg)，溶劑組給予等體積的無菌生理鹽水。分別于術后3 h、7 d、14 d和28 d處死小鼠，計算各組小鼠肺指數，采用生物發光法檢測小鼠肺組織的ATP含量，采用HE染色和苦味酸-天狼星紅染色觀察肺組織的病理學變化，采用real-time PCR法檢測各組肺組織中Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)和轉化生長因子β1(TGF-β1)的mRNA表達水平，采用ELISA法測定肺泡灌洗液TGF-β1的蛋白水平。結果: 與對照組相比，模型組和溶劑對照組小鼠的肺指數和膠原含量明顯升高，證明矽肺模型制備成功。Apy組與溶劑組相比，肺組織的ATP含量下降，肺組織炎癥表現明顯減輕，炎癥評分顯著下降；同時肺指數、膠原容積分數及Col Ⅰ和Col Ⅲ的 mRNA表達水平均顯著下降。Apy可以明顯下調肺組織中TGF-β1的mRNA表達水平和肺泡灌洗液中TGF-β1蛋白表達水平。結論: Apy可以明顯減輕實驗性矽肺小鼠肺組織的炎癥反應和纖維化，該作用可能與Apy減少肺組織ATP的濃度、下調TGF-β1的表達有關。

[關鍵詞]矽肺； 三磷酸腺苷雙磷酸酶； 轉化生長因子β1

矽肺是由于長期吸入含游離二氧化硅(silicon dioxide，SiO2)的粉塵引起的職業性肺疾病，通常表現為持續的炎癥反應、成纖維細胞增生、過量的膠原沉積最終導致肺間質纖維化[1]。目前，矽肺的發病機制尚未明確，且缺乏有效的治療措施。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)是機體組織細胞所需能量的直接來源，且參與各個系統如神經系統、血管系統、免疫系統等細胞之間的信息傳遞[2-4]。大量研究表明，胞外ATP與多種疾病的發生發展有關，如敗血癥、肺纖維化等[5-6]。新近研究發現，通過氣管滴注三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase，Apy)可以減輕博來霉素誘導的急慢性肺損傷[7]，但其對實驗性矽肺的干預研究尚未見報道。因此，本研究使用SiO2誘導小鼠矽肺模型，采用ATP清除劑Apy降低肺組織局部ATP的濃度，觀察Apy對小鼠矽肺發生發展的影響，以期初步探討其在矽肺肺纖維化過程中的作用。

材料和方法

1動物

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。小鼠在12 h/12 h光照周期，通風、溫度和濕度適宜的清潔級動物室內常規飼養，適應性飼養 1 周后用于實驗。

2試劑

三磷酸腺苷雙磷酸酶、ATP檢測試劑盒和0.5～10 μm SiO2顆粒(Sigma)；TRIzol Reagent(Invitrogen)；MMLV反轉錄酶和dNTPs(Promega)；SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(Roche)；TGF-β1 ELISA試劑盒(上海索來寶生物技術有限公司)；異氟烷(國藥準字H19980141，河北一品制藥有限公司)；其余試劑均為國產分析純。

3方法

3.1矽肺模型的制備及標本的采集處理將160只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、矽肺組、Apy組及溶劑組，每組40只。用MIDMARK小動物麻醉罐、2%異氟烷輕度麻醉小鼠，將小鼠上頜中切牙懸掛于特制環形架的橡膠帶上，鑷子夾閉鼻孔，同時從一側嘴角輕輕拉出舌以暴露舌根和咽后壁，將均一的SiO2懸濁液沿咽后壁緩慢注入，確保其隨呼吸運動吸入肺部，結束后將小鼠置于掌心保持上體直立位，直至完全蘇醒[8]。對照組以同樣的方式給予等體積的無菌生理鹽水。Apy組在造模的同時及造模后4 h經口咽吸入Apy溶液，溶劑組經口咽吸入SiO2懸濁液造模，造模后4 h經口咽吸入無菌生理鹽水作為溶劑對照。各組小鼠在造模后的3 h、7 d、14 d和28 d分為灌洗組和非灌洗組取材。將小鼠麻醉后摘眼球放血處死，灌洗組用1 mL預冷無菌生理鹽水行經支氣管肺泡灌洗，重復3次，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)離心后取上清儲存于-80 ℃冰箱備用。非灌洗組開胸取肺，肉眼觀察雙肺，稱量肺臟重量，計算肺系數，肺系數=肺濕重(mg)/體重(g)；右上肺經4%多聚甲醛固定后用Leica TP-1020半自動臺式組織處理機脫水浸蠟，包埋后組織切片進行HE染色、苦味酸-天狼星紅染色；左肺儲存于液氮中，用于肺組織RNA的提取與分析；右下肺儲存于液氮中用于肺組織ATP的檢測。

3.2小鼠肺組織ATP的檢測取出液氮中的右下肺部分，置于冰上并剪成小塊，加入提前預冷的10% HClO4，用KONTES微型電動組織勻漿器勻漿；使用Biofuge stratas離心機4 ℃ 45 000 r/min離心10 min；取500 μL上清置于新的EP管，加入200 μL 2.5 mol/L 的KOH溶液充分混勻，中和HClO4；4 ℃ 45 000 r/min離心10 min后，取上清用pH 7.8的TAE緩沖液稀釋10倍，按照說明書的操作要求，用ATP檢測試劑盒進行檢測，簡述步驟如下：將儲存濃度為400 μmol/L的ATP標準品倍比稀釋，分別得到2 000、1 000、500、250和100 nmol/L的標準品；避光條件下將ATP檢測混合物稀釋25倍；取100 μL工作濃度ATP檢測混合液加入不透明酶標板，靜置2 min以耗竭環境中的本底ATP；將100 μL的ATP標準品或待測樣本加入酶標板，設復孔，振蕩混勻后用PerkinElmer LS55分光光度計測定；根據標準品濃度和吸光度值擬合標準曲線，求出相應方程式并計算各樣本的ATP濃度。

3.3小鼠肺組織的病理學檢測肺組織在4%的多聚甲醛中固定48 h后常規石蠟包埋，切5 μm切片，進行HE染色、苦味酸-天狼星紅染色，用NIKON E300偏振光顯微鏡觀察肺組織炎癥反應和纖維化程度。參照Szapiel等[9]的方法，在放大100倍視野下觀察HE染色切片，每只小鼠取3個連續切片，避開大的氣管和血管后隨機選取5個視野，按以下規則進行炎癥評分：正常組織評為0分，炎癥細胞浸潤面積占肺組織面積比例<20%評為1分，比例為20%～50%評為2分，比例>50%評為3分，取其平均值作為炎癥評分，反映肺組織的炎癥程度。應用Image-Pro Plus 6.0軟件對肺間質纖維化程度進行分析：同一視野用暗場圖像分析膠原面積，明場圖像分析空白區域面積，計算膠原容積分數(collagen vo-lume fraction，CVF)反映肺纖維化程度，計算公式如下：CVF(%)=膠原面積/(圖像總面積-空白區域面積)×100%。

3.4ELISA測定肺泡灌洗液TGF-β1的含量將ELISA試劑盒和待測BALF恢復室溫，按照說明書的操作要求進行檢測，簡述步驟如下：稀釋標準品，將100 μL的標準品或樣本加入酶標板，均設復孔；封板膜封板后37 ℃孵育30 min，棄去液體，洗滌液洗滌5次；加顯色A液、B液各50 μL，振蕩混勻后37 ℃孵育15 min，加中止液50 μL后，Bio-Rad xMark分光光度計測定450 nm和630 nm雙波長下的吸光度，根據標準品做出濃度與吸光度的標準曲線，得出相應的方程，求出各樣本BALF上清TGF-β1的濃度。

3.5小鼠肺組織TGF-β1的mRNA水平檢測采用TRIzol法提取各組肺組織的總RNA，NanoDrop 2000c分光光度計對其進行定量，用RNA甲醛變性電泳法驗證其完整性，之后使用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA，SYBR Green法進行實時定量PCR反應，反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。用2-ΔΔCt法對結果進行分析。所用引物序列如表1所示，引物均由北京中美泰和生物技術有限公司合成。

3.6小鼠肺組織Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ，ColⅠ)和Ⅲ型膠原(collagen typeⅢ，Col Ⅲ)水平的檢測將3.5中提取出的mRNA進行反轉錄，SYBR Green法進行實時熒光定量PCR反應，反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。用2-ΔΔCt法對結果進行分析。所用ColⅠ、Ⅲ引物序列如表1所示，引物均由北京中美泰和生物技術有限公司合成。

4統計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用t檢驗和方差分析，多重比較使用Tukey’s法，相關性采用Pearson相關分析。以P<0.05為差異有統計學顯著性。

表 1　 目的基因引物序列

結果

1肺組織ATP含量的變化

如圖1所示，在矽肺造模后的3 h，矽肺組與對照組相比肺組織ATP濃度顯著升高(P<0.01)；與溶劑對照組相比，Apy組肺組織ATP的含量明顯下降(P<0.01)。

Figure 1. Apyrase (Apy) treatment reduced ATP accumulation induced by silica administration. Mean±SEM. n=5.**P<0.01 vs NS group;##P<0.01 vs silica+Apy group.

圖1 三磷酸腺苷雙磷酸酶干預3 h后小鼠肺組織ATP含量的變化

2各組小鼠肺組織的病理學變化

造模后7 d的HE染色可見，NS組肺組織結構基本正常，而silica組表現為大量的炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬，肺泡結構破壞，炎癥評分顯著升高(P<0.01)；與溶劑組相比，Apy組肺組織炎癥細胞浸潤等肺泡炎的癥狀明顯改善，肺組織炎癥評分顯著降低(P<0.05)，見圖2；造模后28 d肺組織天狼星紅染色表明，矽肺小鼠肺組織在偏振光下可見到呈團塊狀分布的紅色粗大的Ⅰ型膠原及黃綠色細小的Ⅲ型膠原，而Apy干預小鼠肺組織硒結節的數量減少、規模減小，偏振光下觀察到膠原沉積明顯減輕，Image-Pro Plus 6.0軟件分析所得膠原容積分數也顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 2. Histologic changes and inflammation score of the lung tissues from each group 7 d after oropharyngeal aspiration of silica suspension. Mean±SEM. n=5.**P<0.01 vs NS group;#P<0.05 vs silica+Apy group.

圖2三磷酸腺苷雙磷酸酶干預后小鼠肺組織炎癥的變化

3各組小鼠肺指數的變化

28 d矽肺組小鼠肺指數與溶劑組比較差異無統計學顯著性，與對照組相比肺指數顯著升高(P<0.01)；Apy組肺指數與溶劑組相比顯著降低(P<0.01)，見圖3。

4肺組織Col Ⅰ和Col Ⅲ表達的變化

如圖3所示，與對照組相比，矽肺組肺組織ColⅠ和ColⅢ的mRNA表達水平明顯提高(P<0.05)；而Apy組肺組織ColⅠ和ColⅢ的mRNA表達水平與溶劑組相比顯著下降(P<0.05)。

5肺組織TGF-β1 mRNA的表達及肺泡灌洗液TGF-β1蛋白的表達

在矽肺造模的第7天，矽肺組和溶劑組肺組織TGF-β1的mRNA表達水平與對照組相比顯著提高，Apy組肺組織TGF-β1的表達水平與溶劑組比較顯著降低(P<0.05)。與此一致，第7 天 Apy組肺泡灌洗液中TGF-β1蛋白的水平與溶劑組相比明顯降低(P<0.05),見圖4。

Figure 3.Changes of pulmonary fibrosis in the mice with apyrase (Apy) treatment. A: picrosirius red staining revealed that pulmonary fibrosis was attenuated by Apy treatment on day 28 after oropharyngeal aspiration of silica; B: Apy treatment reversed the rising trend of lung index and collagen volume fraction (CVF) of silicosis mice; C: the mRNA expression of collagen typeⅠ and collagen type Ⅲ in each group. Mean±SEM. n=5.**P<0.01 vs NS group;##P<0.01 vs silica+Apy group.

圖3三磷酸腺苷雙磷酸酶干預后小鼠肺組織纖維化程度的變化

6各組小鼠肺組織ATP含量和TGF-β1 mRNA表達水平的相關關系

Apy組小鼠ATP含量和TGF-β1表達水平與溶劑組相比顯著下降，為分析兩者關系，我們將小鼠肺組織ATP含量與相應的肺組織TGF-β1的mRNA表達水平進行相關性分析，結果顯示兩者呈明顯的正相關(r=0.908 1，P<0.01)，見圖4。

Figure 4.Changes of TGF-β1 at mRNA and protein levels in the mice with apyrase (Apy) treatment and the correlation between ATP level and TGF-β1 mRNA level. A: the expression of TGF-β1 at mRNA and protein levels in Apy treatment group were down-regulated; B: the positive correlation between ATP level and TGF-β1 mRNA expression level in the lung tissues. Mean±SEM.n=20.**P<0.01 vs NS group;#P<0.05,##P<0.01 vs silica+Apy group.

圖4三磷酸腺苷雙磷酸酶干預后小鼠TGF-β1在mRNA和蛋白水平表達的變化及其與肺組織ATP的相關關系

討論

矽肺是由于長期慢性吸入游離SiO2引起免疫細胞激活、炎癥介質釋放從而導致慢性炎癥遷延不愈，破壞肺的結構并引起細胞外基質過度沉積，最終導致肺結構的破壞。近年來，國內外學者從免疫調節及細胞因子水平干預等方面對矽肺的發病機制進行了廣泛探索，然而其確切發病機制尚未完全闡明。而最近的研究表明，在維持宿主穩態的過程中，免疫系統不僅可以感受入侵的病原分子，還會受病理過程中產生的各種內源性分子的影響[7]。ATP的積累在感染及纖維化疾病中可以通過調控炎癥通路、激活成纖維細胞等方式，參與炎癥反應及組織重塑的過程[3, 10]。 Riteau等[7]的研究表明，使用Apy經口咽滴入呼吸道可以明顯改善博來霉素導致的小鼠肺纖維化。本研究通過測定肺組織的ATP含量表明，矽肺造模后3 h小鼠肺組織有大量的ATP釋放和積累，而經口咽吸入法給予Apy治療后，氣道中的ATP含量顯著下降，說明Apy清除肺組織局部ATP。與矽肺組相比，我們觀察到Apy組7 d小鼠肺組織炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡結構破壞等肺泡炎的癥狀明顯減輕，炎癥評分顯著下降；28 d小鼠肺組織膠原的沉積明顯減輕，膠原容積分數及肺系數顯著下降，而肺組織Col Ⅰ和Col Ⅲ的表達水平也明顯下降，表明Apy干預減輕了矽肺小鼠早期肺組織炎癥和晚期肺纖維化。

Harris等[11]認為，TGF-β1是促進肺纖維化的最直接的細胞因子，是最強的細胞外基質沉淀促進劑，在調控肺成纖維細胞增殖分裂及膠原蛋白的合成與降解過程中發揮重要作用。多項研究表明TGF-β1水平可作為矽肺早期檢測的指標之一，也是治療矽肺的潛在作用靶點[12-13]。在Apy干預矽肺小鼠的過程中，我們觀察到Apy組TGF-β1在基因和蛋白水平表達均下調，且小鼠急性炎癥期肺泡炎的表現及后期纖維化的表現均顯著緩解。肺組織ATP含量和肺組織TGF-β1 mRNA表達水平的相關性分析表明兩者呈明顯的正相關，因此Apy可能是通過降低肺組織ATP調控TGF-β1的表達從而減少膠原的沉積、成纖維細胞的增生以達到緩解矽肺的目的。

綜上所述，使用Apy可能通過局部清除呼吸道ATP而影響TGF-β1的表達，減輕矽肺的炎癥和纖維化表現。下一步的研究擬通過Apy清除ATP的體內外實驗，探討ATP在矽肺中促炎癥、促纖維化作用的具體分子機制及其作為矽肺預防和治療靶點的可能性。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Intervention effects of apyrase on silica-induced pulmonary fibrosis in mice

SU Cheng-cheng1, XIANG Guo-an1, MA Yong-qiang2, ZHOU Xin2, PENG Shou-chun1, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1Department of Respirology and Critical Care Medicine, Pingjin Hospital, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces,2Tianjin Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Target Organ Injury, Institute of Cardiovascular Disease and Heart Center, Tianjin 300162, China. E-mail: ji_wenjie@hotmail.com; wei_luqing@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of apyrase on the experimental silicosis. METHODS: C57BL/6 male mice were randomly divided into control group, silica treatment group, silica+apyrase group and silica+NS group. A mouse model of lung fibrosis was induced by crystalline silica particles (50 mg/kg, via oropharyngeal instillation), and were sacrificed at 3 h, 7 d, 14 d and 28 d. Apyrase was delivered by oropharyngeal aspiration at the same time and 4 h after silica challenge. The lung indexes were calculated and the concentration of ATP was detected by bioluminescent assay. The mRNA expression levels of collagen type Ⅰ(Col Ⅰ), collagen type Ⅲ (Col Ⅲ) and transforming growth factor β1 (TGF-β1) were examined by real-time PCR. The protein levels of TGF-β1 in bronchoalveolar lavage fluid were measured by ELISA. RESULTS: The elevated lung index and collagen levels showed that silicosis model was established successfully. Compared with silica group, apyrase treatment significantly alleviated silica-induced inflammation, reduced inflammation score on day 7， and decreased the lung index, collagen volume fraction and the mRNA expression of Col Ⅰand Col Ⅲ on day 28. Treatment with apyrase effectively down-regulated the mRNA levels of TGF-β1 in the lung tissues and TGF-β1 protein levels in bronchoalveolar lavage fluid on day 7.CONCLUSION: Apyrase attenuates the pulmonary inflammation and fibrosis of silicosis, which may be related with down-regulation of ATP and TGF-β1 in the lung tissues.

[KEY WORDS]Silicosis; Apyrase; Transforming growth factor β1

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0792- 06

[收稿日期]2016- 01- 07[修回日期] 2016- 03- 16

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81102088; No. 81441101)；天津市自然科學基金資助項目(No. 13JCYBJC22000; No. 15JCZDJC35000)；武警后勤學院附屬醫院重點項目(No. FYZ201510; No. FYZ201605)；武警后勤學院附屬醫院種子基金資助項目(No. FYM201538)

通訊作者△姬文婕 Tel: 022-60577283； E-mail: ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel: 022-60578671； E-mail: wei_luqing@hotmail.com

[中圖分類號]R135.2; R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.004

雜志網址： http://www.cjpp.net

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