螺內酯對實驗性矽肺小鼠的干預研究*

向國安，　蘇程程，　張譯丹，　馬永強，　周　欣，　魏路清，　姬文婕

(1中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院呼吸與重癥醫學科，天津 300162； 2中國人民武裝警察部隊福建總隊醫院，福建 福州 350000；3中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院心臟中心，心血管病研究所，天津 300162)

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螺內酯對實驗性矽肺小鼠的干預研究*

向國安1▲，蘇程程1▲，張譯丹2，馬永強3，周欣3，魏路清1△，姬文婕1△

(1中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院呼吸與重癥醫學科，天津 300162；2中國人民武裝警察部隊福建總隊醫院，福建 福州 350000；3中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院心臟中心，心血管病研究所，天津 300162)

[摘要]目的： 探討螺內酯(spirolactone，SPI)在實驗性小鼠矽肺病理進展中的作用及機制。方法: 將120只雄性C57 BL/6小鼠(18～20 g)隨機分為生理鹽水組(NS組)、石英組(quartz組)、石英+生理鹽水組(quartz+NS組)和石英+螺內酯組(quartz+SPI組)，經口咽吸入石英混懸液建立實驗性小鼠矽肺模型；quartz+SPI組及quartz+NS組每天分別經灌胃給予螺內酯10 mg/kg或等體積的生理鹽水。術后3 d、14 d和28 d處死小鼠，行常規支氣管肺泡灌洗術，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進行細胞分類和計數；采用ELISA法檢測BALF上清中轉化生長因子β1(TGF-β1)的含量；采用HE染色、Masson染色和免疫熒光染色觀察肺組織病理學變化及纖維化程度；采用RT-qPCR檢測各組肺組織中膠原I(Col I)、膠原III(Col III)及TGF-β1的mRNA表達水平。結果: 經口咽吸入石英后，小鼠肺組織經歷了典型的急性炎癥期和纖維化期改變，給予SPI干預后的小鼠肺組織炎癥反應程度相比于quartz+NS組減輕(P<0.05)。給予螺內酯干預后，在第3天小鼠肺組織TGF-β1 的mRNA表達量顯著下調(P<0.01)，BALF中TGF-β1的含量也顯著減少(P<0.01)。到第28天，quartz+SPI組小鼠肺組織Col I、Col III的mRNA表達量明顯低于quartz+NS組(P<0.05)。結論: SPI可能通過調控TGF-β1的mRNA表達，減少TGF-β1蛋白的分泌，從而改善石英導致的早期急性炎癥反應，并在纖維化期減輕了Col I和Col III的mRNA表達，抑制了纖維化的進展。

[關鍵詞]石英； 肺纖維化； 螺內酯； 轉化生長因子β1

矽肺是由于長期吸入大量游離石英粉塵所引起，以肺部廣泛性結節性肺纖維化為主要特征的疾病。矽肺病理發展呈不可逆性，脫離暴露因素后患者肺功能仍進行性惡化，目前尚無有效治愈方法[1-3]。近年來研究發現，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)不僅參與內環境穩態調節，還在肺組織炎癥、修復和纖維化過程中起到重要作用。作為典型的胞核甾體類激素受體，鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)在多個靶器官系統的促炎癥和促纖維化作用越來越被重視，螺內酯(spirolactone，SPI)是公認的MR拮抗劑。選擇性敲除單核巨噬細胞系MR，能夠減輕慢性鹽皮質激素導致的心肌纖維化[4]。本研究采用實驗性小鼠矽肺模型， 探討MR拮抗劑SPI對石英誘導小鼠肺纖維化的影響，并明確其對實驗性矽肺肺損傷炎癥反應及纖維化的作用及分子機制。

材料和方法

1動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，18～20 g，購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。實驗前小鼠均適應性飼養1周。飼養環境實施12 h/12 h明暗周期，保持恒定通風、溫度和濕度。

2主要試劑

游離石英粉塵和螺內酯(Sigma)；TRIzol Reagent (Invitrogen)；MMLV反轉錄酶和dNTPs(Promega)；SYBR Green 實時定量PCR試劑盒(Roche)；轉化生長因了β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其余國產試劑均為分析純。所用引物由北京鼎國昌盛生物技術有限公司根據設計合成。

3主要方法

3.1小鼠矽肺模型的制備、標本的采集與處理120只雄性C57BL/6小鼠隨機分為生理鹽水組(NS組)、石英組(quartz組)、石英+生理鹽水組(quartz+NS組)和石英+螺內酯組(quartz+SPI組)，經2%異氟烷麻醉后，采取經口咽吸入法建立實驗性矽肺模型，quartz組按100 mg/kg劑量給予石英混懸液40 μL，待小鼠完全吸入并蘇醒后常規飼養；NS組吸入同等體積的無菌生理鹽水；模型制備完成后quartz+SPI組和quartz+NS組還需分別按每日10 mg/kg的劑量經灌胃給予SPI或等體積的無菌生理鹽水。在術后第3天、14天、28天麻醉后處死小鼠，血漿分裝保存于-80 ℃備用。每個時點每組取5只小鼠行經支氣管肺泡灌洗術，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)后進行細胞計數和分類，上清分裝后置于-80 ℃保存。未灌洗的小鼠左肺用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，右肺凍存于液氮中用于提取RNA。

3.2病理學分析小鼠肺組織經固定、石蠟包埋、連續切片(3 μm～5 μm)后，采用HE染色觀察炎癥反應，用炎癥評分(inflammation score，IS)代表炎癥反應程度；采用Masson染色及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫熒光檢測膠原纖維含量，用膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)代表纖維化程度。

3.3BALF細胞計數和分類BALF回收后經4 ℃、3 000 r/min離心15 min，用D-Hanks液重懸細胞團，采用Countstar自動細胞計數儀計數，甩片后經4 ℃無水乙醇固定30 min、HE染色，普通光學顯微鏡下連續計數200個細胞，統計巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例。上清分裝保存于-80 ℃備用。

3.4ELISA檢測BALF上清中TGF-β1的含量嚴格按照TGF-β1 ELISA試劑盒操作說明進行BALF上清中TGF-β1含量的檢測及建立標準曲線。簡述步驟如下，每個待測樣品渦旋混勻后取100 μL進行檢測，采用酶標儀分別在450 nm 和630 nm處測吸光度(A)值，最終使用兩種A值之差(A492-A630)進行分析。

3.5RT-qPCR檢測肺組織中mRNA的表達水平采用Trizol Reagent試劑盒分離純化第3天和第28天各組肺組織的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照OneStep Real-Time PCR試劑盒推薦的標準操作步驟，在ABI 7300熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR，內參照使用β-actin，擴增條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環。根據GenBank 數據庫中目的基因cDNA 序列，使用Primer Premier 6.0 軟件設計特異性引物，由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成(表1)，使用2-ΔΔCt法對RT-qPCR結果進行分析。

表1　引物序列

4統計學處理

采用STATA 14.1軟件進行統計分析。正態分布計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析和SNK法兩兩比較。不滿足正態性或方差齊性，以中位數、四分位間距描述原始數據，并采用非參數秩和Mann-Whitney檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1小鼠肺組織病理學變化

普通光學顯微鏡下可見NS組肺組織結構基本正常，未見明顯的炎癥細胞浸潤和膠原纖維沉積。與NS組相比，quartz組及quartz+NS組的小鼠在第3天可見肺組織有大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔水腫增厚，可見部分肺泡腔陷閉，IS明顯高于NS組(P<0.01)，給予鹽皮質激素受體拮抗劑SPI干預的quartz+SPI組炎性細胞浸潤及肺泡腔增厚與quartz組及quartz+NS組相比較輕，肺泡結構相對完整，IS低于quartz+NS組，差異均有統計學顯著性(P<0.05)。隨著時間的進展， Masson染色和α-SMA免疫熒光染色結果顯示， quartz組和quartz+NS組肺組織在第28天均出現成纖維細胞增殖、膠原沉積，并可觀察到纖維結節及大量致密藍染膠原纖維或大量α-SMA陽性區域，該2組的CVF值均顯著高于NS組(P<0.01)；與quartz+NS組比，給予鹽皮質激素受體拮抗劑SPI干預的quartz+SPI組肺部病變減輕，CVF顯著低于quartz+NS組(P<0.01)，見圖1、2。

Figure 1.Spironolactone reduced quartz-induced alveolitis (A), and the synthesis and secretion of TGF-β1 (B) were down-regulated. Mean±SD. n=5.**P<0.01 vs NS group;#P<0.05,# #P<0.01 vs quartz+NS group.

圖1螺內酯減輕了石英誘導的肺泡炎癥，下調了TGF-β1的合成與分泌

Figure 2.Spironolactone attenuated quartz-induced pulmonary fibrosis. A: Masson’s trichrome staining and the immunofluorescent staining of α-SMA (FITC-labeled, green; nuclei were counterstained by DAPI); B: the mRNA expression of Col I and Col III in the lung tissues on day 28 after quartz challenged. Mean±SD. n=5.**P<0.01vsNS group;##P<0.01vsquartz+NS group.

圖2螺內酯減輕石英誘導的肺纖維化

2BALF細胞計數和分類比較

與NS組相比，quartz和quartz+NS組小鼠BALF細胞總數在第3、14天均明顯升高。而quartz+SPI組小鼠BALF細胞總數明顯低于quartz+NS組，并且中性粒細胞數變化也呈相同趨勢。在急性炎癥期(第3天)，quartz+SPI組小鼠BALF的巨噬細胞數略低于quartz+NS組，差異無統計學顯著性；第14天，quartz+NS組的巨噬細胞數明顯增高，而給予SPI干預的小鼠巨噬細胞數明顯少于quartz+NS組(P<0.05)，見表2。由此推測，SPI可減輕急性期和纖維化期肺泡炎性細胞浸潤。

表2　3 d和14 d各組肺泡灌洗液細胞計數分類結果的比較

**P<0.01 vs NS group;#P<0.05,##P<0.01 vs quartz+NS group.

3SPI下調TGF-β1的mRNA表達水平及蛋白合成

染塵后第3天，與NS組相比較，quartz 組及quartz +NS組小鼠肺BALF上清中的TGF-β1 含量及肺組織中TGF-β1的mRNA表達水平均呈一致性升高(P<0.05)；而經灌胃給予SPI的quartz+SPI組小鼠肺BALF上清中的TGF-β1 含量及肺組織中TGF-β1 的mRNA表達水平相對于quartz +NS組明顯降低(P<0.05)，見圖1。

4小鼠肺組織中Col I和Col III的mRNA表達

造模后第28天quartz小鼠肺組織Col I和Col III的mRNA表達量較NS組明顯升高，然而，quartz+SPI組小鼠肺組織Col I和Col III的mRNA表達量均低于quartz+NS組(P<0.05)，由此看出，給予SPI干預可以抑制石英刺激后小鼠肺組織Col I和Col III的mRNA的表達升高，見圖2。

討論

近年來研究報道顯示，RAAS活性增高在慢性心血管和其它疾病的炎癥和重塑病理學機制中起了很重要的作用，同時也是肺損傷的發病機制中重要因素之一[5-6]。作為RAAS的效應環節，醛固酮涉及到多類纖維化相關的慢性炎癥疾病的發病機制[7-8]。目前巨噬細胞MR在石英誘發的急性肺損傷和肺纖維化中的作用尚不明確。

TGF-β1是公認的促進纖維化形成和發展的關鍵性細胞活性物質，其在肺纖維化中發揮了至關重要的作用。大量研究表明TGF-β1通過促進成纖維細胞的增殖、聚集以及轉換為成肌纖維細胞表型，從而參與了細胞外基質蛋白的沉積，這是肺纖維化的形成的重要機制之一。Neveu等[9]的新近研究表明，TGF-β1可通過修飾肺成纖維細胞中胸腺細胞分化抗原1(Thy-1)的表達，加重特發性肺纖維化的程度。TGF-β1還可通過促進肺成纖維細胞產生ROS，進而導致JNK的激活以及Col I、Col III的合成[10]。另有研究表明，游離石英粉塵在大鼠矽肺模型中通過刺激肺組織可引起大鼠血清中含量的增加，且表明TGF-β1合成與分泌在炎癥期和纖維化期起了重要作用[11]。阻斷MR能夠減輕博來霉素誘發的纖維化的現象已經被廣泛認可[12-14]，我們實驗室的前期研究也證明了SPI減輕博來霉素誘發的肺纖維化可能是通過影響MCP-1 和TGF-β1的表達來實現的[15]。SPI作為一種利尿藥物，在臨床已廣泛使用，我們由此受到啟發去進一步探索SPI在治療游離石英粉塵誘導的肺纖維化中作用。

在本研究中，采用經口咽吸入游離石英粉塵建立小鼠實驗性矽肺模型，灌胃給予SPI干預實驗性矽肺小鼠。通過研究我們發現，經SPI干預后實驗性矽肺小鼠急性肺組織炎癥反應和肺組織膠原纖維的沉積都得到了緩解，肺纖維化的病理進展得到了抑制，同時，小鼠肺組織中TGF-β1mRNA和蛋白的表達水平也都下調。這與本實驗室前期研究中發現SPI能減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的結果是相一致的。肺巨噬細胞是石英顆粒作用的主要靶細胞，IFN-γ和TNF-α或LPS可誘導產生M1型巨噬細胞，隨之釋放大量ROS、NO及促炎細胞因子，引起過度的炎癥反應與組織損傷，最終激發了纖維化；而M2型巨噬細胞則分泌大量抗炎因子如IL-4、IL-10和IL-13，主要有下調炎癥反應與啟動損傷修復的作用，并在控制細胞增殖、膠原沉積和組織修復中發揮了關鍵的作用[16]。同時，有報道顯示石英可通過上調肺泡巨噬細胞和成纖維細胞中TGF-β1的表達, 增加膠原合成而參與矽肺纖維化的發展[17]。我們接下來擬通過體內外實驗，進一步探討巨噬細胞表型偏移在通過阻斷MR抑制石英誘導的纖維化進展中的作用及其作為潛在肺纖維化預防和治療靶點的可能性。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of spirolactone on mouse model of experimental silicosis

XIANG Guo-an1, SU Cheng-cheng1, ZHANG Yi-dan2, MA Yong-qiang3, ZHOU Xin3, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1DepartmentofRespiratoryMedicineandIntensiveCareUnit,HospitalAffiliatedtoLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China；2FujianPeople’sArmedPoliceCorpsHospital,Fuzhou350000,China;3CardiacCenter,InstituteofCardiovascularDiseases,HospitalAffiliatedtoLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei-luqing@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of spirolactone (SPI) in the progression of quartz-induced experimental silicosis mouse model. METHODS: Male C57BL/6 mice (n=120, 18～20 g) were randomly divided into normal saline (NS) group, quartz group, quartz+SPI group and quartz+NS group. Oropharyngeal aspiration of quartz suspension was performed to make model. The mice in quartz+SPI group and quartz+NS group were treated with SPI (10 mg /kg) or the same volume of NS daily by oral gavage throughout the experiment. The mice were sacrificed following anesthesia on days 3, 14 and 28 after treatment. The total number and different types of bronchoalveolar lavage fluid (BALF)-derived cells were routinely counted. HE staining, Masson’s trichrome staining and immunofluorescent staining were used to conduct histopathologic examination. The mRNA expression levels of collagen I (Col I), collagen III (Col III) and transfor-ming growth factor-β1(TGF-β1) were examined by real-time PCR. The content of TGF-β1 in BALF was measured by ELISA. RESULTS: The classical pathological stages of quartz-induced lung injury, including acute inflammation phase (3 d), progressive fibrosis phase (14 d) and late fibrosis phase (28 d), were observed. Compared with quartz+NS group, the inflammatory responses of the lungs in quartz+SPI group were attenuated in the acute inflammation phase, and the degree of fibrosis was significantly reduced at 28 d after the inspiration of quartz. After the treatment with SPI, the mRNA expression of Col I, Col III and TGF-β1 in the lung tissues was effectively down-regulated. Meanwhile, the content of TGF-β1 in BALF was reduced. CONCLUSION: Treatment with SPI may significantly attenuates quartz-induced early inflammatory responses of the lung tissues by regulating the mRNA expression of TGF-β1 and secretion of TGF-β1 protein, and reduces the mRNA expression of Col I and Col III at fibrotic phase, resulting in the inhibition of the progression of fibrosis.

[KEY WORDS]Quartz; Lung fibrosis; Spirolactone; Transforming growth factor-β1

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0947- 06

[收稿日期]2016- 02- 22[修回日期] 2016- 03- 29

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81570335； No. 81441101)；武警后勤學院附屬醫院項目(No. FYJ201510； No. FYZ201402； No. FYZ201538)

通訊作者△姬文婕 Tel: 022-60577283; E-mail: ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel： 022-60578671； E-mail： wei_luqing@hotmail.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.031

雜志網址： http://www.cjpp.net

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