百合固金湯合生脈散加減方對肺結核模型大鼠肺組織MIF、TNF-α蛋白表達的影響*

李樹義　鮑承賢　董雪松　河北省唐山市第九醫院(唐山063000)

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·實驗研究·

百合固金湯合生脈散加減方對肺結核模型大鼠肺組織MIF、TNF-α蛋白表達的影響*

李樹義鮑承賢董雪松△河北省唐山市第九醫院(唐山063000)

摘要目的：觀察百合固金湯合生脈散加減方對肺結核模型大鼠肺組織MIF、TNF-α蛋白表達的影響。方法：將昆鼠制備肺結核模型，隨機分為模型組、對照組和實驗組，每組30 只。感染第 2 天開始，模型組每日灌胃生理鹽水6mL/kg，連續灌胃3個月；對照組用利福平濃度3g/mL，6 mL/kg進行灌胃治療 ；實驗組應用百合固金湯合生脈散加減方，濃度3g/mL，6 mL/kg進行灌胃治療，觀察3個月。檢測周圍血T細胞亞群的變化和肺結核結節組織MIF、TNF-α蛋白表達變化。結果：對照組和實驗組與模型組比較，周圍血T細胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%有明顯提高，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組和實驗組與模型組比較，肺結核結節中MIF蛋白含量有明顯降低，差異性有統計學意義(P<0.05)。對照組和實驗組與模型組比較，肺結核結節中TNF-α蛋白含量有明顯降低，差異性有統計學意義(P<0.05)；實驗組與對照組比較，TNF-α蛋白含量有所降低，差異性有統計學意義(P<0.05)結論：百合固金湯合生脈散加減方可有效提高周圍血T細胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%，減低肺結核結節組織MIF、TNF-α蛋白含量。

主題詞結核,肺/中醫藥療法百合固金湯/治療應用生脈散/治療應用動物實驗大鼠

肺結核是一種肺部感染性疾病，祖國醫學在防治此疾病具有獨特的優勢，本研究應用百合固金湯合生脈散加減方對肺結核鼠模型進行干預，觀察肺結核結節組織MIF、TNF-α蛋白表達及周圍血T細胞亞群的變化，來探究此中藥復方在防治肺結核作用機制。

1材料與方法1.1 實驗動物昆明種小鼠90只,雌雄各半,體重(20±5) g,清潔級,購于購于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養于華北理工大學實驗動物中心溫度、濕度、通風良好。

1.2試劑與儀器百合固金湯合生脈散加減方(百合、熟地、生地、當歸、白芍等)； 結核分支桿菌 H37Rv 購于中國藥品與生物制品鑒定所；利福平膠囊購自廣東金葫蘆制藥有限公司，批號 2013546；沈陽萬類生物科技有限公司夠置以下產品：BCA蛋白定量試劑盒；Western Blot一抗二抗去除液(強堿性)；Western及IP細胞裂解SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒；DAB顯色試劑盒(20x)；巨噬細胞移動抑制因子(MIF)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體。低溫高速離心機(湖南湘立科學儀器有限公司);GeIDocTMXR+成像系統(Bio-Rad )；多功能電泳儀(北京鴻濤基業科技發展有限責任公司)。

1.3方法1.3.1 分組與模型制備:常規喂養1周后隨機數字隨機分為3組: 模型組、對照組和實驗組，每組30只。按照參考文獻[1]鼠尾靜脈注射5 mg/mL的結核桿菌懸液0.2mL，形成肺結核動物模型。

1.3.2 處理方法:感染第 2 天開始，模型組每日灌胃生理鹽水6mL/kg，連續灌胃3個月；對照組用利福平濃度3g/mL，6mL/kg進行灌胃治療 ；實驗組應用百合固金湯合生脈散加減方，濃度3g/mL，6 mL/kg進行灌胃治療，觀察3個月。

1.4觀察指標及方法1.4.1周圍血T細胞亞群的變化:采集眼靜脈血2mL，分離低溫保存。采用MCAB-A-E花樣環法,按常規操作[2]。

1.4.2 肺結核結節組織MIF、TNF-α蛋白表達的檢測:將肺結核結節組織細胞裂解，離心提取組織總蛋白，取蛋白，上樣到10%/15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳、電轉，將硝酸纖維素膜(NC)孵育兔來源 MIF、TNF-α第一抗體，4℃過夜。DBS液清洗，孵育山羊抗兔第二抗體，CL 染色，膠片顯影、定影。膠片掃描后，使用 Image J 軟件處理條帶灰度值。

2結果2.13組周圍血T細胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%的變化對照組和實驗組與模型組比較，周圍血T細胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%有明顯提高，差異有統計學意義(P<0.05)； 對照組與實驗組比較，差異性無有統計學意義(P>0.05),見表1。

表1　周圍血T細胞亞群的變化±s )

注：與模型組比較，?P<0.05

2.2三組肺結核結節MIF、TNF-α蛋白含量變化 對照組和實驗組與模型組比較，肺結核結節中MIF蛋白含量有明顯降低，差異性有統計學意義(P<0.05)。對照組和實驗組與模型組比較，肺結核結節中TNF-α蛋白含量有明顯降低，差異性有統計學意義(P<0.05)；實驗組與對照組比較，TNF-α蛋白含量有所降低，差異性有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　三組肺結核結節MIF、TNF-α/β-actin 比值

注：與模型組比較，?P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05

3討論細胞免疫功能低下可誘發肺結核發病[3-4]，MIF對于抵抗胞內病原微生物具有先天的免疫作用，TNF-α也直接參與結核病的免疫應答，它們是參與肺結核免疫應答及免疫發病過程的重要細胞因子[5-6]。研究顯示MIF、TNF-α在肺結核結節中的出現高表達，并且成正相關。兩者在肺結核結節中可能互相誘導、刺激,放大炎性反應，MIF抑制巨噬細胞游走,促進其在炎癥局部浸潤、激活、增生并分泌炎性細胞因子，激發結核分枝桿菌的作用[7]。

中醫藥在防治肺結核發揮著越來越重要的作用，其中本研究中應用的百合固金湯合生脈散加減方依據與肺結核病理特點配伍組成，具有潤肺生津，清熱化痰止咳等作用。研究表明：百合固金湯合生脈散加減方可有效提高周圍血T細胞中CD3+%、CD4+%、CD8+%，減低肺結核結節組織MIF、TNF-α蛋白含量加強免疫應答，進而控制慢性感染。

參考文獻

[1]TANG M,KEMP A,VARIGOS G.IL-4 and interferon-gamma pr-oduction in children with atopic disease[J].Clin Exp Immunol,1993,92(1):120-124.

[2]辛麗紅,王靜,王貞,等.肺炎支原體感染對哮喘患兒支氣管肺泡灌洗液中T細胞功能的影響[J].中國當代兒科雜志,2014,16(3):277-280.

[3]陳廷,聶尚丹,趙建磊,等.肺結核患者免疫功能狀態的研究[J].中華疾病控制雜志,2011,15(5):381-383.

[4]段靜,侯超,毛源.老年與青年肺結核患者免疫功能差異的探討[J].實用老年醫學,2014,28(11):937-940.

[5]李靜.MIF基因啟動子多態性與肺結核病遺傳易感性關系的研究[D].碩士學位論文昆明醫科大學基礎醫學院2014,5:73-74.

[6]李紅,唐神結.肺結核患者外周血SIL-2R、TNF-α、IFN-γ、IL-6檢測及意義[J].中國防癆雜志,2011,33(1):57-60.

[7]漆沄,石志紅,茍超倫.MIF、TNF-A在肺結核組織中表達和意義的初步探討[J].中國防癆雜志,2011,33(3):153-157.

(收稿2015-10-09;修回2015-11-13)

【中圖分類號】R256.17

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.02.047

通訊作者：? 唐山市第四醫院 (唐山063000)

*國家自然基金資助項目(81303046)

河北省中醫藥管理局科研計劃項目(2015163)