山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、序列分析及原核表達

鮑長磊，何亞鵬，張　琪，許信剛，張彥明，付明哲

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌　712100)

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山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、序列分析及原核表達

鮑長磊，何亞鵬，張琪，許信剛，張彥明，付明哲

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌712100)

摘要根據GenBank已登錄的GTPV基因組序列，設計并合成1對特異性引物，以GTPV疫苗株基因組DNA為模板，PCR擴增獲得 ORF103基因片段并進行序列分析，再將該基因片段亞克隆于原核表達載體pET-28a中，構建重組質粒pET- ORF103，經鑒定正確后轉化BL21感受態細胞進行誘導表達，并進行SDS-PAGE和Western blot檢測。成功克隆GTPV疫苗株 ORF103基因片段。重組菌經IPTG誘導后成功表達分子質量約為35 ku的重組蛋白，該蛋白能與山羊痘陽性血清特異性結合，具有良好的反應原性。研究結果為GTPV的分子生物學特性研究提供資料，并為進一步研制GTPV抗體檢測試劑盒奠定基礎。

關鍵詞山羊痘病毒； ORF103基因；基因克隆；序列分析；原核表達

山羊痘(Goatpox)是由山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)引起山羊的一種高度接觸性傳染病，主要以發熱、呼吸困難、流黏液性或膿性鼻液及在皮膚黏膜出現痘疹為特征，病死率較高，能造成巨大的經濟損失，嚴重影響國際貿易和養羊業的發展[1-3]。世界動物衛生組織(OIE)將該病列為必須通報的動物傳染病，中國將其列為一類動物疫病。GTPV屬痘病毒科(Poxiridae)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)，是在細胞漿內復制的有囊膜的雙股DNA病毒，共有147個開放閱讀框(ORF)，其序號按照1條單鏈5′到3′的順序依次編號為001～156[4-5]。該基因組結構在功能上分為2部分，其中心區( ORF024～ORF123)構成1部分，包含與其他痘病毒同源的保守序列，編碼病毒復制所需的蛋白，主要在病毒的轉錄、RNA修飾、DNA復制以及病毒粒子組裝等過程中發揮作用[6]。另1部分則由2個末端基因組區組成( ORF1～ORF23和 ORF124～ORF156)，由一些推測可能具有毒力和宿主范圍的基因組成[7]。 ORF103分布在基因組的保守區，為病毒粒子核心蛋白，在病毒顆粒組裝過程中發揮重要作用[8]。本試驗對山羊痘 ORF103基因進行克隆，并應用生物學軟件預測ORF103蛋白氨基酸序列的信號肽、跨膜結構域、疏水性、抗原指數和表面分布可能性，以期了解ORF103蛋白的分子結構特征，為探究山羊痘病毒分子生物學及其裝配機制奠定基礎;其次構建GTPV ORF103基因的原核表達載體,并在大腸埃希菌系統中誘導表達，為下一步研究GTPV血清學診斷抗原奠定基礎。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1病毒、菌種和質粒山羊痘病毒(GTPV)弱毒疫苗株AV41為山東綠都生物科技有限公司產品；pEASY-T1 Cloning Kit、感受態細胞Trans5a、BL21為北京全式金生物技術有限公司產品；pET-28a質粒由西北農林科技大學動物醫學院獸醫微生物實驗室保存。

1.1.2主要試劑各種內切酶、T4DNA連接酶購于NEB公司；2×EsTaqMasterMix、DL2 000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、廣譜蛋白Marker購于北京康為世紀生物科技有限公司；Blue plus Ⅱ Protein Marker購自北京全式金生物技術有限公司；血液/組織/細胞基因組提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；IPTG購自Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊IgG抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3血清GTPV陽性血清為采自臨床免疫過GTPV弱毒疫苗株AV41的羊血清。

1.2方 法

1.2.1引物設計與合成根據GenBank中登錄的山羊痘病毒基因組序列(AY077835.1)，通過NCBI ORF Finder工具查詢 ORF103基因序列，利用Premier 5.0設計 ORF103的特異性引物(ORF103-F/ORF103-R)，上游引物:5′-CGCGGATCCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)；下游引物:5′-CCGCTCGAGATCCATACCATCGTCGATAG-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)，擴增片段長度為570 bp，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2病毒基因組DNA的提取取200 μL稀釋的弱毒疫苗，根據血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA，-20 ℃保存，備用。

1.2.3 ORF103基因的擴增以提取的GTPV基因組DNA為模板，50 μL PCR反應體系：2×ESTaqMastermix 25 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌ddH2O 21 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。膠回收 ORF103目的片段，連接至pEASY-T1載體并轉化克隆感受態細胞，培養并PCR鑒定，提取陽性質粒并命名為pEASY-T1-ORF103。

1.2.4原核表達載體pET- ORF103的構建BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pEASY-T1-ORF103及pET-28a空質粒，瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切產物。T4連接酶將回收的 ORF103目的片段與線性化pET-28a質粒于4 ℃連接過夜。將連接產物轉化克隆感受態細胞Trans 5α中。挑取單克隆后擴大培養，分別進行PCR和雙酶切鑒定后送華大基因(北京)測序，測序正確的重組質粒命名為pET- ORF103。

1.2.5 ORF103的序列分析及編碼蛋白的結構預測利用NCBI BLAST功能將 ORF103 測序結果與GenBank已收錄的羊痘病毒基因組DNA序列( KC951854.1、AY077836.1、AY077835.1、AF325528.1 AF409137.1、AY077832.1、AF409138.1、AY077834.1、AY077833.1)進行比對。利用Internet在線軟件預測 ORF103編碼蛋白的信號肽 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和跨膜區(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。利用DNA Star軟件預測分析蛋白的親水性、抗原指數和表面分布可能性。

1.2.6重組蛋白ORF103的誘導表達及表達條件優化將鑒定為陽性的重組質粒pET- ORF103和pET-28a空載體分別轉化表達感受態細胞BL21，挑取單克隆，37 ℃、220 r/min過夜培養，按φ=1% 轉接5 mL新鮮LB培養基后，培養至對數期(約3～3.5 h)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，誘導5 h后收集1.5 mL菌液的菌體，100 μL PBS洗滌1次后用100 μL PBS重懸，超聲裂解30 min。加入100 μL 2×Loading Buffer混勻，沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取5 μL上清進行SDS-PAGE。

其他條件不變，摸索不同IPTG終濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)和不同誘導時間(3～6 h)對重組蛋白表達的影響，優化重組蛋白表達的條件。

1.2.7重組蛋白ORF103表達形式分析在最佳誘導條件下，分別取菌液上清、菌體超聲裂解上清和沉淀進行SDS-PAGE，分析重組蛋白的表達形式。

1.2.8ORF103蛋白的Western blot分析將重組蛋白表達產物進行常規SDS-PAGE后，250 mA恒流轉膜2.5 h。以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h后，以1∶500倍稀釋的山羊痘陽性血清4 ℃孵育PVDF膜過夜。TBST振蕩洗滌3次，每次15 min。將PVDF膜以1∶5 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊IgG抗體室溫孵育2 h，TBST振蕩洗滌3次，每次15 min。ECL反應液孵育PVDF膜，暗室壓片曝光。同時設立陰性對照。

2結果與分析

2.1PCR擴增結果

以GTPV弱毒疫苗株AV41提取的基因組DNA為模板，PCR擴增得到570 bp的 ORF103基因片段，與預期大小相符(圖1)。

2.2原核重組質粒的鑒定

重組質粒pET- ORF103經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，同時雙酶切pET-28a載體作陰性對照，瓊脂糖凝膠電泳后出現570 bp的目的條帶和5 369 bp的載體條帶，載體條帶與陰性對照大小相同，目的條帶與PCR鑒定相符，說明重組質粒構建正確(圖2)。

2.3 ORF103的序列分析及編碼氨基酸的結構預測

NCBI BLAST后發現 ORF103測序結果與GenBank已收錄的羊痘病毒基因組DNA序列(KC951854.1、AY077836.1、AY077835.1、AF325528.1 AF409137.1、AY077832.1、AF409138.1、AY077834.1、AY077833.1)相似性在97%以上，表明GTPV的 ORF103基因較為保守。利用Internet在線軟件預測ORF103氨基酸序列，結果表明該氨基酸序列沒有信號肽(圖3)和跨膜區(圖4)。利用DNA Star分析ORF103多肽氨基酸序列的親水性、抗原指數和表面分布可能性，結果見圖5。

M. DNA marker DL2000；1. ORF103擴增產物Amplification of ORF103

圖1 ORF103基因的擴增

Fig.1Amplification of ORF103 gene by PCR

M. DNA marker DL10000；1. pET-28a 經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-28a digested usingBamH ⅠandXhoⅠ；2. pET- ORF103經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET- ORF103 digested usingBamHⅠandXhoⅠ；3.PET- ORF103 PCR鑒定 Identification of pET- ORF103 by PCR

圖2重組表達質粒的雙酶切鑒定

Fig.2Digestion identifications of recombinant plasmid

圖3　信號肽預測

圖4　跨膜區預測

圖5　ORF103蛋白序列的親水性、抗原指數和表面分布可能性分析

2.4重組蛋白誘導表達條件的優化

其他條件不變，使用不同濃度的IPTG誘導重組蛋白的表達，結果顯示當IPTG終濃度為1 mmol/L時，重組蛋白ORF103表達量最大(圖6)；在不同誘導時間(3～6 h)下，結果顯示在誘導6 h后，重組蛋白ORF103表達量顯著增加(圖7)。pET-28a空質粒對照組和pET- ORF103未誘導對照組均沒有重組蛋白的表達。

M. 蛋白分子質量標準Protein marker；1. 誘導pET-28aInduced cells containing pET-28a；2. 未誘導pET- ORF103 Uninduced cells containing pET- ORF103；3～7. 分別用終濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG誘導pET- ORF103 Cells containing pET- ORF103 induced with 0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 mmol/L IPTG, respectively

圖6不同濃度IPTG對ORF103重組

蛋白誘導表達的影響

Fig.6Effects of different IPTG concebtration on

expression of ORF103 fusion protein

M. 蛋白分子質量標準Protein marker；1. 誘導pET-28a Induced cells containing pET-28a；2. 未誘導pET- ORF103 Uninduced cells containing pET- ORF103；3～7. 分別誘導3，4，5，6 h的pET- ORF103 Cells containing pET- ORF103 induced for 3, 4, 5 and 6 h，respectively

圖7不同誘導時間對ORF103

重組蛋白誘導表達的影響

Fig.7Effects of different induction time on

expression of ORF103 fusion protein

2.5重組蛋白ORF103表達形式的分析

在最佳誘導條件下，分別取菌液上清、菌體超聲裂解上清和沉淀進行SDS-PAGE，結果顯示重組蛋白ORF103以包涵體的形式存在(圖8)。

2.6重組蛋白的Western blot分析

Western blot結果顯示，ORF103重組蛋白能與山羊痘陽性血清發生特異性反應出現特異性條帶，而與陰性對照轉染空載體pET-28a的重組菌不反應(圖9)。

M. 蛋白分子質量標準Protein marker；1. 菌液上清Supernatant of lysogeny broth；2. 菌體裂解上清Soluble lysates；3. 菌體裂解沉Insoluble lysates

圖8ORF103重組蛋白表達形式分析

Fig.8Form of expression of ORF103 fusion protein

M. 蛋白分子質量標準Protein marker；1. ORF103重組蛋白ORF103 fusion protein；2. pET-28a對照菌pET-28a control

圖9ORF103重組蛋白的Western blot結果

Fig.9Western blot analysis of ORF103 fusion protein

3討 論

本研究成功克隆GTPV疫苗株AV41 ORF103的全長基因，并將其與NCBI上登錄的其他GTPV毒株的 ORF103基因進行核苷酸序列比較分析。結果表明，該疫苗株與其他GTPV毒株的核苷酸序列相似性超過97%，其中與中國福建分離株FZ毒株同源性最高，核苷酸同源達100%，表明GTPV的 ORF103基因較為保守。利用在線生物軟件預測ORF103蛋白序列，分析表明ORF103蛋白沒有信號肽序列和跨膜結構域。氨基酸抗原性和親水性分析表明，ORF103具有較強的抗原性和親水性。且抗原性峰值和親水性峰值基本同步。 ORF103基因編碼的蛋白具有良好的抗原性，成為臨床上診斷GTPV感染的理想抗原，必將在GTPV的診斷及血清學調查中發揮巨大作用。

大腸埃希菌表達系統具有方便、高效、簡單、可操作性強等優點。雖然表達產物無法進行正確的糖基化修飾及容易形成不溶性包涵體，但應用于與功能活性無關的免疫學研究仍然十分理想[9]。本試驗將 ORF103基因克隆于pET-28a原核表達載體T7啟動子的下游，與His-tag同框融合，構建pET- ORF103原核表達載體，并在宿主菌BL21中成功誘導表達GTPV ORF103蛋白。表達的分子質量約為35 ku，與預期結果相符，這也與李慧霞等[10]原核表達的ORF103蛋白大小一致。

羊痘分布范圍很廣，主要分布于非洲、亞洲、印度次大陸、歐洲部分地區。該病在中國的廣東、廣西、江蘇、貴州、甘肅、山東、浙江、黑龍江等地均有發生，部分地區呈暴發性流行[11]。羊痘對流行區的養羊業造成很大危害，但目前尚沒有方便、有效的檢測方法用于畜產品的國際貿易和羊痘的流行病學檢測。雖然山羊痘血清學診斷技術很多，比如瓊脂凝膠擴散試驗(AGP)、對流免疫電泳技術(CIE)、熒光抗體技術(FAT)、反向間接血凝試驗(RPHA)和正向間接血凝試驗(IHA)[12]。但是這些方法都存在一定局限性，或操作不方便，或特異性不強，或敏感性不高。近年來，ELISA 方法因其操作方便、快速、敏感、特異性強、便于自動化，現已被廣泛應用于各種病原抗原或抗體的檢測。本試驗利用大腸埃希菌成功表達ORF103蛋白，Western blot結果顯示表達的ORF103蛋白能與羊痘陽性血清特異性結合，表明表達的ORF103蛋白具有很好的反應原性，可以作為ELISA診斷試劑盒的候選抗原，為后續ELISA診斷試劑盒的研制奠定基礎。

參考文獻Reference：

[1]ROY P,PURUSHOTHAMAN V,SREEKUMAR C,etal.Sheep pox disease outbreaks in Madras Red and Mechery breeds of indigenous sheep in Tamilnadu,India [J].ResearchinVeterinaryScience,2008,85(3):617-621.

[2]BHANUPRAKASH V,INDRANI B K,HOSAMANI M,etal.The current status of sheep pox disease[J].ComparativeImmunology,MicrobiologyandInfectiousDiseases,2006,29(1):27-60.

[3]吳錦艷,田宏,陳妍,等.基于山羊痘病毒P32蛋白ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫學報,2014,34(12):1906-1911.

WU J Y,TIAN H,CHEN Y,etal.The development of anindirect ELISA method based on the goat pox virus P32 gene[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2014,34(12):1906-1911(in Chinese with English abstract).

[4]RAO T V,BANDYOPADHYAY S K.A comprehensive review of goat pox and sheep pox and their diagnosis[J].AnimalHealthResearchReviews,2000,1(2):127-136.

[5]陳軼霞.羊痘病毒基因組及其功能研究概況[J].中國獸醫學報,2015,35(2):340-344.

CHEN Y X.The research overview of genome and features of sheeppox and goatpox virus[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2015,35(2):340-344(in Chinese with English abstract).

[6]SEET B T,JOHNSTON J B,BRUNETTI C R,etal.Poxviruses and immune evasion[J].AnnualReviewofImmunology,2003,21(1):377-423.

[7]TULMAN E R,AFONSO C L,LU Z,etal.Genome of lumpy skin disease virus[J].JournalofVirology,2001,75(15):7122-7130．

[8]TULMAN E R,AFONSO C L,LU Z,etal.The genomes of sheeppox and goatpox viruses[J].JournalofVirology,2002,76(12):6054-6061.

[9]STUDIER F W,ROSENBERG A H,DUNN J J,etal.Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes[J].MethodsEnzymol,1990,185:60-89.

[10]李慧霞,朱學亮,劉振勇,等.羊痘野毒感染與弱毒免疫iELISA鑒別診斷方法的建立[J].中國獸醫科學,2013,43(7):701-706.

LI H X,ZHU X L,LIU ZH Y,etal.Development of iELISA for differentiation of natural infection of capripox from vaccinated animals[J].ChineseVeterinaryScience,2013,43(7):701-706(in Chinese with English abstract).

[11]顏新敏,吳國華,李健,等.羊痘在中國的流行現狀分析[J].中國農學通報,2010,26(24):6-9.

YAN X M,WU G H,LI J,etal.The analysis on epidemic situation of capripox in China[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2010,26(24):6-9(in Chinese with English abstract).

[12]周碧君,馮元璋,許樂仁.山羊痘血清學診斷技術研究[J].中國預防獸醫學報,2006,28(4):423-426.

ZHOU B J,FENG Y ZH,XU L R.Comparison study of serologic diagnosis techniques for goat pox[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine,2006,28(4):423-426(in Chinese with English abstract).

Received 2015-12-06Returned2015-12-21

Foundation itemScientific and Technological Projects of Shaanxi Province(No.2015NY162)；Technology Achievement Project of Demonstration Station (Base) of Northwest A&F University(No.TGZX2015-32).

First authorBAO Changlei,male,master student.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:1250038797@qq.com

ZHANG Yanming,male,Ph.D,professor.Research area:microbiology and immunology. E-mail: zhangym@nwsuaf.edu.cn

(責任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Cloning, Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of ORF103 Gene of Goatpox Virus Vaccine Strain

BAO Changlei,HE Yapeng,ZHANG Qi,XU Xingang,ZHANG Yanming and FU Mingzhe

(College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

AbstractAccording to the published sequence of ORF103 gene of GTPV, a pair of specific primers were designed and synthesized. The ORF103 gene was amplified by PCR from goatpox virus vaccine strain. ORF103 gene sequence was analyzed and cloned into pET-28a vector. The prokaryotic expression plasmid pET- ORF103 containing ORF103 gene was successfully constructed. The expression of recombinant plasmid pET- ORF103 in BL21 was induced and detected by SDS-PACE and Western blot analysis. ORF103 gene was successfully obtained. SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein had molecular weight of about 35 ku by IPTG induction. Western blot analysis showed that the fusion protein had well reactiongenicity. These results provide basic information of ORF103 gene and protein in goatpox virus vaccine strain. Further more, the ORF103 protein can be used to prepare GTPV antibody detection kit.

Key wordsGoatpox virus； ORF103 gene；Gene clone；Sequence analysis；Prokaryotic expression

收稿日期：2015-12-06修回日期：2015-12-21

基金項目：陜西省科技攻關(2015NY162)；西北農林科技大學試驗示范站(基地)科技成果推廣(TGZX2015-32)。

通信作者：付明哲，男，碩士，高級獸醫師，研究方向為羊病學。E-mail：286567031@qq.com

中圖分類號S852. 61

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0502-06

Corresponding authorFU Mingzhe, male,master,senior veterinary officer.Research area: sheep disease. Email:286567031@qq.com

網絡出版日期：2016-04-02

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1111.008.html

第一作者：鮑長磊，男，碩士研究生，研究方向為分子病原學與免疫學。E-mail：1250038797@qq.com

張彥明，男，博士，教授，研究方向為分子病原學與免疫學。E-mail：zhangym@nwsuaf.edu.cn