Th22型免疫反應在動脈粥樣硬化疾病中的動態變化

萬軍，石磊，吉慶偉，施瑩，劉伶，陸政德，馮穎，葉晶，林英忠

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Th22型免疫反應在動脈粥樣硬化疾病中的動態變化

萬軍，石磊，吉慶偉，施瑩，劉伶，陸政德，馮穎，葉晶，林英忠

摘要

目的：探討Th22型免疫反應與動脈粥樣硬化（AS）之間的關系，為治療AS提供新的理論依據。

方法：8周齡C57BL/6J背景的載脂蛋白E缺陷型（ApoE-/-）小鼠為實驗組（n=24），同齡C57BL/6J小鼠為對照組（n=24），兩組小鼠均給予高脂飲食，分別于0周、4周、8周、12周處死，并采用油紅O染色檢測不同時間點主動脈根部斑塊的進展，流式細胞術檢測Th22細胞在兩組小鼠脾臟中比例變化，實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測主動脈中白細胞介素-22（IL-22）、白細胞介素-22受體1（IL-22R1）及其轉錄因子芳香烴受體（AhR）、T盒21轉錄因子（T-bet）的信使核糖核酸（mRNA）表達量變化，酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清中的IL-22含量變化。

結果：實驗組小鼠主動脈根部粥樣斑塊面積［主動脈根部斑塊面積/主動脈管腔面積（%）］、Th22細胞［CD4+IL-22+/ CD4+（%）］數量、IL-22、IL-22R1、AhR、T-bet的 mRNA在主動脈中的表達量以及IL-22在血清中的含量均高于同時間點對照組小鼠，且各時間點（0周除外）差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組組內前后兩時間點對比，主動脈粥樣斑塊面積及AhR、T-bet的 mRNA表達量：4周與0周、8周與4周、12周與8周比較差異均有統計學意義；Th22細胞數量：4周與0周、8周與4周比較差異均有統計學意義，12周與8周比較差異無統計學意義；IL-22、IL-22R1的 mRNA表達量及血清中IL-22含量：4周與0周比較差異有統計學意義，8周與4周、12周與8周比較差異無統計學意義。

結論：亢進的Th22型免疫反應具有促進AS進程的作用，其機制有待進一步探討。

關鍵詞動脈粥樣硬化；Th22細胞；白細胞介素-22

作者單位：430000湖北省武漢市，武漢大學人民醫院心血管內科（萬軍、石磊、馮穎、葉晶）；廣西壯族自治區人民醫院心血管內科（吉慶偉、施瑩、劉伶、陸政德、林英忠）

（Chinese Circulation Journal，2016，31：454.）

動脈粥樣硬化（AS）是一種多因素的動脈血管壁的慢性炎癥性疾病，大量研究表明，其與先天性免疫和獲得性免疫密切相關［1］。研究發現，在AS 進展的各個時期，斑塊處都發現有T 淋巴細胞的浸潤［2］，且主要為是CD4+ T 淋巴細胞浸潤［3，4］。Th22 是一種新型 CD4+ T 細胞，其生物學效應由白細胞介素（IL）-22實現。IL-22屬于IL-10 家族，其受體是由IL-22受體1（IL-22R1）和IL-10受體2（IL-10R2）組成。IL-10R2廣泛分布于機體組織上，IL-22R1則主要表達于腸道、呼吸道的上皮細胞，皮膚角質細胞以及肝臟細胞等。IL-22功能的實現主要通過作用于IL-22R1來實現。芳香烴受體（AhR）和T盒21轉錄因子（T-bet）是Th22 的特征性轉錄因子，在誘導Th22分化及IL-22的生成中起著重要作用。 Th22被認為主要參與皮膚的自穩和病理過程，其在牛皮癬及類風濕關節炎等慢性炎性病變過程中發揮著重要的促炎癥作用［5，6］。相關研究表明，冠心病患者外周血Th22比例、AhR表達、IL-22含量顯著高于對照組，這提示Th22 可能通過分泌功能因子IL-22 參與AS 進程［7］。本實驗擬采用載脂蛋白E缺陷型（ApoE-/-）小鼠建立AS模型，檢測疾病進展過程中Th22細胞數量，IL-22含量，IL-22、IL-22R1、AhR、T-bet的 mRNA的動態變化，初步探討Th22型免疫反應是否參與AS進程。

1 材料與方法

主要試劑：異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD4熒光抗體、藻紅素（PE）標記的IL-22熒光抗體及其同型抗體、細胞刺激劑（含蛋白阻滯劑）、IL-22酶聯免疫吸附測定法（ ELISA）試劑盒（Ebioscience ，美國），逆轉錄試劑盒、核酸染料SYBR Green RTPCR一步法試劑盒（Takara Biotechnology ，日本）。

實驗動物分組及處理：C57BL/6J背景的ApoE-/-雄性小鼠為實驗組（n=24）； C57BL/6J雄性小鼠為對照組（n=24）；兩組小鼠均為8周齡，體重20～25 g，高脂飼料飼養0周、4周、8周、12周后分別處死作如下檢測（小鼠與飼料均購自北京華阜康生物科技股份有限公司）。

組織準備：3% 戊巴比妥鈉（10 μl/g）麻醉小鼠，摘除眼球取血，剪取心臟、脾臟，取、分離主動脈，均-80℃低溫保存。

兩組小鼠AS斑塊面積的測定：將主動脈竇進行OCT包埋，低溫冰凍，連續8 μm切片，取相隔100 μm的5片切片組織用4%的福爾馬林固定后進行油紅O染色，用圖像軟件（Image-Pro Plus 6.0）分析斑塊面積。

流式細胞術（FACS）檢測脾臟中Th22細胞數量［CD4+IL-22+/CD4+（%）］：新鮮脾臟在預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）［0.1%NaN3+0.5%牛血清蛋白（BSA）+2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH 7.2］中充分研磨，用100目的鋼絲網過濾，加等體積淋巴細胞分離液降速離心，分離出中間層淋巴細胞；PBS清洗2遍，再用PBS 100 μl重懸，得到淋巴細胞懸液（細胞數量105～106），細胞根據計數等分為測定管和同型對照管。按說明書加入FITC標記的CD4熒光抗體4℃避光孵育30 min，清洗2遍，用RPMI-1640培養基和10%滅活的胎牛血清重懸，轉移到24孔板中（1 ml/孔），加入細胞刺激劑（2 μl/孔），充分混合，在37℃ 5% CO2環境中孵育6 h，轉移至5 ml 的EP管中，清洗2遍，固定和破膜后進行胞內細胞因子染色，測定管按說明書要求加入PE標記的IL-22熒光抗體，對照管加入相應的同型對照抗體，4℃避光孵育30 min，清洗2遍，重懸，上機檢測Th22細胞數量。使用FlowJo 7.6流式軟件進行分析。

RT-PCR檢測IL-22、IL-22R1、AhR和T-bet 的mRNA表達水平：用組織剪將分離的主動脈剪碎，Trizol研磨至組織完全溶解，按說明書提取總RNA。以提取的總RNA 為模板，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA 第一鏈，-20℃保存。在NCBI 數據庫中查詢β-肌動蛋白（β-actin）、IL-22、IL-22R1、AhR、T-bet 基因序列，應用primer 5.0設計引物與探針（表1），交由上海英駿生物技術有限公司合成。以制備的cDNA 為模板，根據核酸染料SYBR Green RT-PCR一步法試劑盒說明書分別擴增β-actin、IL-22、IL-22R1、AhR、T-bet，并得出熒光曲線和相應的△Ct值。以4周齡的C57BL/6J小鼠中各值為參照，采用2-△△Ct法分析目標基因的相對表達量。每個樣品設置3 個復孔。RT-PCR 反應在Bio-Rad CFX Manager 2.1系統上進行，重復3 次。

表1　引物序列

ELISA 法檢測小鼠血清中IL-22含量：取已制備好的血清，按ELISA 試劑盒說明書操作，即刻測量標本A450值，根據說明書繪制標準曲線，并根據標準曲線查找其對應的濃度范圍。每組樣品點3孔。

統計學方法：采用SPSS 18.0統計學分析軟件對數據進行分析，結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組小鼠AS斑塊面積進展變化的比較：隨著高脂飼養時間的延長，實驗組小鼠AS斑塊面積不斷增加，0周、4周、8周、12周時AS斑塊面積的前后時間點對比差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1）。而對照組小鼠并無AS斑塊形成。除0周外，其它3個時間點實驗組小鼠的AS斑塊面積均顯著高于同期對照組小鼠，差異均有統計學意義（P＜0.05，表2）。

圖1　實驗組小鼠主動脈根部粥樣斑塊油紅O染色及斑塊面積進展變化圖（×10）

表2　兩組小鼠各項指標組間及組內對比（n=24，±s）

表2　兩組小鼠各項指標組間及組內對比（n=24，±s）

注：AS：動脈粥樣硬化；IL-22：白細胞介素-22；IL-22R1：白細胞介素-22受體1；T-bet：T盒21轉錄因子；AhR：芳香烴受體。與對照組相比*P＜0.05**P＜0.01 ；實驗組組內前后時間點比較△P＜0.05△△P＜0.01

組別　AS 斑塊面積 （%）Th22細胞數量 （%）IL-22 mRNA （倍）IL-22R1 mRNA （倍）T-bet mRNA （倍）AhR mRNA （倍）IL-22 （pg/ml）0周對照組　0　1.10±0.42　1.03±0.34　1.05±0.28　1.01±0.16　1.04±0.23　9.29±1.38實驗組　1.12±0.64　1.53±0.63　1.69±0.74　1.63±0.24　1.36±0.23　1.16±0.18　12.92±2.74 4周對照組　0　1.10±0.36　1.21±0.25　0.99±0.19　1.04±0.17　0.98±0.12　11.37±2.94實驗組　12.37±4.63**△△　2.82±0.33**△△　6.03±1.17**△△　3.14±1.12**△△　2.47±0.49*△　1.39±0.05**△△　28.28±7.51**△△8周對照組　0　1.26±0.36　1.05±0.42　1.03±0.19　1.08±0.18　1.06±0.11　11.44±3.12實驗組　22.78±4.38**△△　3.98±0.68**△△　6.48±1.96**　3.91±0.42**　3.91±0.86**△　1.46±0.06**△△　29.86±5.51**12周對照組　0　1.09±0.27　1.18±0.33　1.08±0.19　1.04±0.21　1.01±0.22　9.85±2.45實驗組　30.19±6.64**△△　3.43±0.90**　5.05±1.58**　3.63±0.60**　2.80±0.69**△　1.67±0.10**△△　24.61±5.27**

兩組小鼠Th22細胞數量在AS中的動態變化的比較（圖2、表2）：除0周外，實驗組小鼠Th22細胞數量在各個時間點均顯著高于對照組小鼠；本組內8周較4周升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2　兩組大鼠流式細胞術檢測脾臟中Th22細胞［CD4+IL-22+/CD4+T（%）］數量變化對比圖

IL-22、IL-22R1、AhR和T-bet的 mRNA在主動脈中表達水平的動態變化（表2）：實驗組小鼠與對照組比較，0周時，IL-22、IL-22R1、AhR和T-bet 的mRNA在主動脈中表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05）；經高脂飲食后4、8、12周，觀察各項指標差異均有統計學意義（P＜0.05）。在變化趨勢上，實驗組IL-22、IL-22R1和T-bet的 mRNA均在8周時達到最大值；實驗組IL-22及IL-22R1的mRNA在主動脈中表達水平在4周時即達到較高值，且組內前后兩時間點對比：8周與4周、12周與8周比較差異無統計學意義（P＞0.05）。T-bet的 mRNA在0～8周呈持續上升趨勢，12周時有所下降，同8周時相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組小鼠AhR 的 mRNA在0～12周的高脂飲食過程中呈現持續上升趨勢，4周時與0周時相比，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），至12周時，較前均有明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

兩組小鼠IL-22在血清中含量的動態變化（表2）：實驗組血清中IL-22含量在各時間點均高于同期對照組，且4周、8周、12周時差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。實驗組小鼠血清中IL-22含量于8周達到最大值，組內前后兩時間點對比，4周與0周比較差異有統計學意義，8周與4周、12周與8周比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

目前已有大量關于AS與CD4+T細胞各細胞亞群之間關系的研究。Th1、Th17細胞已被證實有促進AS的作用，而Treg則可預防AS的發生，Th2 的特征因子IL-4具有促AS 作用，但Th2 另兩種細胞因子IL-5和IL-33已證實具有顯著地抑制AS進程的作用，因此Th2 型免疫反應在AS的進程中所起的總體作用仍有待明確［8-10］。

Th22 是2009 年在人體發現的獨立于Th1、Th2 和Th17 的一種新型效應性T 細胞［11］。AhR在誘導Th22分化及IL-22的生成中起著主要作用，而這一作用的發揮需要的T-bet的協同作用，二者相互補充，共同實現Th22分化及IL-22的生成的最佳效應，當AhR高度表達時，T-bet可對以上效應起主要調節作用［12］。本實驗中二者在實驗組小鼠中的表達水平均高于同條件下對照組小鼠，二者呈現出的動態變化在一定程度上互補，12周Th22及IL-22稍有下降趨勢（差異無統計學意義），很可能是由于T-bet的調節作用主導。Basu 發現，在炎癥的早期，IL-22 主要由淋巴組織誘導細胞分泌，在炎癥的中晚期則主要由Th22 細胞分泌，提示Th22 可能在慢性炎癥性疾病中扮演了重要的角色。IL-22 的靶細胞為非免疫細胞，主要是上皮細胞，也作用于內皮細胞［13］和平滑肌細胞［14］等組織細胞。

研究發現，Th22 細胞通過分泌IL-22 作用于不同的靶細胞，誘導細胞生長因子及炎性因子產生，并發揮其多種生物效應。IL-22可以促進類風濕關節炎患者滑膜成纖維細胞增殖和生成單核細胞趨化蛋白（MCP-1）［15］；在牛皮癬疾病中，IL-22可促進角化細胞的分化和遷移并上調多種促炎因子的表達［16］。此外，多項研究表明IL-22下游信號是由JAK-STAT通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路介導。而JAK-STAT已明確證實與AS 進程中氧化應激、細胞損傷與凋亡有關，并參與凋亡因子Fas、IL-8和IL-6的基因調控，而MAPK 更是與血管平滑肌細胞的表型轉換、遷移和增殖密切相關，并參與不少炎癥因子的基因調控。由此我們推測Th22可能通過其細胞因子IL-22激活JAK-STAT 通路和MAPK 通路，誘導細胞生長因子及炎性因子產生，參與機體的病理性免疫應答反應，從而加劇AS進程。

Th22作為一種最新發現的新型CD4+T細胞，其在AS中的作用及機制研究尚處在初級階段。相關免疫組化證實IL-22存在于AS患者粥樣斑塊中，且有癥狀患者斑塊中IL-22含量約為無癥狀患者的7.5倍［17］。而我們一項臨床研究發現急性心肌梗死、不穩定性心絞痛患者外周血中Th22細胞、IL-22因子含量及轉錄因子AhR的 mRNA表達量均明顯高于穩定性心絞痛患者和正常對照組。本實驗結果顯示實驗組小鼠中Th22細胞的數量、IL-22、IL-22R1、AhR、T-bet的mRNA在主動脈中表達水平顯著高于同條件下的對照組小鼠，這表明，Th22型免疫反應可能在AS的發生發展中發揮著重要作用，具有促進AS進程的作用。

本實驗初步證實Th22型免疫反應存在于AS進程中，且很可能發揮著促進AS的作用，為進一步探索其病理機制提供了理論依據。對Th22型免疫反應在冠心病中作用的認識，進一步證實和完善了AS 發病的炎癥學說和Th 細胞亞群功能失衡理論，加深我們對AS 這一免疫介導的慢性炎癥性疾病的病理生理機制的理解，有望成為急性冠狀動脈綜合征炎癥干預的新靶點。

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（編輯：曹洪紅）

臨床研究

Dynamic Changes of Type Th22 Cell Immunological Response During Atherosclerosis Process in Experimental Mice

WAN Jun，SHI Lei，JI Qing-wei，SHI Ying，LIU Ling，LU Zheng-de，FENG Ying，YE Jing，LIN Ying-zhong.
Department of Cardiology，Wuhan University People’s Hospital，Wuhan （430000），Hubei，China

Abstract

Objective：To study the dynamic changes of type Th22 cell immunological response during atherosclerosis process in experimental mice in order to provide a new theoretical basis for atherosclerosis therapy.

Methods：8 weeks C57BL/6J mice were divided into 2 groups：Experiment group，n=24 ApoE-/-mice and Control group，n=24 normal mice.All animals received high fat diet and the following indexes were compared between 2 groups at 0，4，8，12 weeks after treatment：aortic atherosclerotic lesions were defined by Oil red O staining，dynamic changes of Th22 cells in spleen were measured by flow cytometry，mRNA expressions of interleukin-22 （IL-22），IL-22R1，AhR and T-bet in aorta were examined by RT-PCR，blood levels of IL-22 was detected by ELISA.

Results：Compared with Control group，Experiment group had the increased area of aortic atherosclerosis （the ratio of plaque area/lumen area） and Th22 cell （CD4+IL-22+/CD4+T cell） amount，elevated mRNA expressions of IL-22，IL-22R1，AHR，T-bet in aorta and higher blood levels of IL-22 at all time points，the differences between each time point （except 0 week）had the statistic meaning，P＜0.05.In Experiment group，the differences between 2 adjacent time points，for the area of aortic atherosclerosis and mRNA expressions of AHR，T-bet：4 weeks vs 0 week，8 weeks vs 4 weeks，12 weeks vs 8 weeks all had statistic meaning； for Th22 cell amount：4 weeks vs 0 week，8 weeks vs 4 weeks had statistic meaning and 12 weeks vs 8 weeks had no real distinction； for mRNA expressions of IL-22，IL-22R1 and blood levels of IL-22：4 weeks vs 0 week had statistic meaning and 8 weeks vs 4 weeks，12 weeks vs 8 weeks had no real distinctions.

Conclusion：Hyperactive immunological response of Th22 cells might be involved in atherosclerosis process，the relevant mechanism should be further studied.

Key wordsAtherosclerosis； Th22 cells； Interleukin-22

基金項目：國家自然科學基金項目（81360055，81460061和81560085），廣西醫療衛生重點科研課題（重2011119），廣西自然科學基金項目（2013GXNSFAA019265）

作者簡介：萬軍主任醫師博士主要從事心肌病和心律失常的基礎與臨床研究Email：wanjun1963@126.com通訊作者：林英忠Email：yingzhonglin@126.com

中圖分類號：R541

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）05-0454-05

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.05.009

Corresponding Author：LIN Ying-zhong，Email：yingzhonglin@126.com

收稿日期：（2015-09-22）