通絡藥物對血管內皮細胞與單核細胞黏附作用的影響

李紅蓉，位庚，孫穎，李輝欣，梁俊清，賈振華

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通絡藥物對血管內皮細胞與單核細胞黏附作用的影響

李紅蓉，位庚，孫穎，李輝欣，梁俊清，賈振華

摘要

目的：觀察氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）損傷的血管內皮細胞（HUVEC）與人白血病單核細胞（THP-1）的黏附作用，以及通絡藥物（通心絡超微粉溶液和人參皂苷Rb1）干預的影響。

方法：采用ox-LDL建立血管內皮細胞損傷模型，將細胞分為正常對照組、模型組、通心絡組和人參皂苷Rb1組。實驗采用MTS比色法檢測ox-LDL損傷的HUVEC的生存活性，用活細胞染色方法觀察不同組HUVEC與THP-1細胞的黏附率，用酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法檢測HUVEC培養上清中單核細胞趨化因子（MCP-1）、可溶性血管內皮細胞間黏附分子（sVCAM-1）、可溶性內皮細胞間黏附分子（sICAM-1）、E-選擇素（E-selectin）的水平，用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測各組HUVEC條件培養基培養的單核細胞趨化因子受體2（CCR2）、極遲抗原4（VLA-4）、巨噬細胞分化抗原-1（Mac-1）的表達。

結果：與正常對照組（100.00±1.31）%比較，模型組HUVEC生存活性降低為正常對照組的（75.57±1.02）%，通心絡組和人參皂苷Rb1組HUVEC生存活性明顯分別提高了（99.25±1.40） %、（99.48±2.15） %。與正常對照組比較，模型組黏附于HUVEC的THP-1細胞數量明顯增多，與模型組比較，通心絡組和人參皂苷Rb1組黏附于HUVEC細胞的THP-1細胞數量減少。通心絡組和人參皂苷Rb1組HUVEC細胞培養上清中MCP-1、sVCAM-1、sICAM-1、E-selectin的水平和THP-1細胞上相應受體CCR2、VLA-4、Mac-1的表達較模型組降低。上述比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

結論：通心絡和人參皂苷Rb1能夠保護HUVEC，減少ox-LDL損傷的血管內皮細胞趨化、黏附分子的分泌及單核細胞上相應受體的表達，從而抑制單核細胞向受損血管內皮的趨化黏附。

關鍵詞通心絡；人參皂苷Rb1；氧化低密度脂蛋白；內皮，血管；單核細胞

作者單位：050017河北省石家莊市，河北醫科大學（李紅蓉、位庚）；泰安市中醫醫院（孫穎）；河北以嶺醫藥研究院國家中醫藥管理局重點研究室（李輝欣、梁俊清、賈振華）

（Chinese Circulation Journal，2016，31：480.）

氧化低密度脂蛋白 （ox-LDL）等危險因素損傷血管內皮細胞（HUVEC），通過信號傳導通路改變內皮細胞分泌活性，介導單核細胞對內皮細胞的黏附進而形成脂質條紋、脂質斑塊是動脈粥樣硬化（AS）的初始環節。通心絡是絡病理論指導研制的通絡代表方藥，具有血管、血液、心臟三重保護作用，人參作為君藥有益氣通絡、保護血管內皮的作用。本研究觀察ox-LDL損傷的HUVEC與人白血病單核細胞（THP-1）的黏附作用及通絡藥物（通心絡超微粉溶液和人參皂苷Rb1）干預的影響。

1 材料與方法

材料：HUVEC、THP-1 （購自中國科學院上海細胞庫），通心絡超微粉（石家莊以嶺藥業），人參皂苷Rb1標準品（以下簡稱Rb1，購自北京中科儀友化工技術研究院），DMEM培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清（美國Gibco），胰蛋白酶（美國Amersco），ox-LDL（北京協生生物科技有限責任公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑，內鹽（MTS）細胞生存活性檢測試劑（美國Promega），Hoechst 33342細胞核染料（美國AAT Bioquest），單核細胞趨化因子（MCP-1） 酶聯免疫吸附測定（ ELISA）試劑盒（美國abcam），可溶性細胞間黏附分子（sICAM-1）、可溶性血管細胞間黏附分子（sVCAM-1）、E-選擇素（E-selectin） ELISA試劑盒（美國R﹠D Systems），兔抗人單核細胞趨化因子受體2（CCR2）、極遲抗原4 （VLA-4）、巨噬細胞分化抗原-1（Mac-1）抗體（美國abcam），BCA 蛋白定量分析試劑盒、細胞核/細胞質蛋白抽提試劑盒（美國Pierce ）。多功能酶標儀（美國BioTek），轉膜儀（美國Bio-Rad），odyssey掃膜儀（美國Li-Cor）、顯微鏡（德國ZEISS）。

通心絡超微粉溶液的制備：取適量通心絡超微粉溶于無血清DMEM培養基，超聲促溶1 h，6 500 g離心10 min，收集上清液并用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，離心所得沉淀于60 ℃加熱烘干并稱量，以校正和計算所得上清中藥物濃度，于-20℃保存備用，用時稀釋至目標濃度。

分組及給藥：實驗分為4組，正常對照組以無血清培養基培養24 h，模型組以含有ox-LDL （30 μg/ml）的無血清培養基培養24 h，通心絡組（150 μg/ml ） 和人參皂苷Rb1組 （120 μg/ml） 的無血清培養基預培養4 h，再加入ox-LDL（30 μg/ml）、通心絡（150 μg/ml ） 及人參皂苷Rb1（120 μg/ml ） 繼續培養24 h。

各組HUVEC生存活性：將對數生長期的HUVEC以1×105/ml 接種于96孔板，10% FBS、37℃、5% CO2培養箱中靜置培養，待細胞生長至90%融合，棄去原培養基。按上述方法處理細胞，每組設4個復孔，參照文獻［1］用MTS比色法檢測各組HUVEC生存活性。

HUVEC與THP-1黏附率測定：按前述方法將HUVEC接種于玻底96孔板常規培養，并對各組細胞進行相應處理，黏附率檢測方法參照文獻［2］并進行改進，將正常培養的THP-1細胞用Hoechst 33342 染料進行活細胞核染色15 min，PBS洗去多余染料，用無血清培養基重懸，以5×105/ml 密度加入到處理好的HUVEC中，共培養6 h，PBS洗去未黏附的THP-1細胞，用活細胞成像系統觀察發生黏附的THP-1，用Image J圖像處理系統計算各視野THP-1細胞數。

酶聯免疫吸附測定法檢測HUVEC培養上清中MCP-1、sVCAM-1、sICAM-1、E-selectin水平檢測：按上述方法處理HUVEC，收集各組細胞培養上清，依參照文獻［3］按ELISA試劑盒說明書所示檢測HUVEC培養上清中MCP-1、sVCAM-1、sICAM-1、E-selectin的水平。

蛋白免疫印跡方法檢測各組THP-1細胞CCR2、Mac-1、VLA-4蛋白的表達：按上述方法將HUVEC接種于6孔板，并對各組細胞進行相應處理，棄去各組細胞培養基，加入無血清培養基培養12 h，然后收集各組細胞培養上清作為條件培養基培養THP-1細胞24 h，收集各組THP-1細胞，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，用蛋白免疫印跡方法測定各組蛋白表達情況，實驗重復3次。

統計學方法：應用SPSS19.0統計學軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較進行方差齊性檢驗和單因素方差分析，方差齊同，采用LSD方法；方差不齊，用Dunnett T3方法進行方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組HUVEC生存活性變化的比較：與正常對照組比較（100.00±1.31）%，模型組HUVEC生存活性降低為正常對照組的（75.57±1.02）%，差異有統計學意義（P＜0.01）；通心絡組和人參皂苷Rb1組HUVEC生存活性分別提高（99.25±1.40） %、（99.48±2.15） %，差異有統計學意義（P＜0.01）；通心絡組與人參皂苷Rb1組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

各組HUVEC與THP-1細胞黏附數量的比較：與正常對照組THP-1黏附數量［（113±31）個］比較，模型組黏附于HUVEC的THP-1數量［（877±152）個］明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，通心絡組和人參皂苷Rb1組黏附于HUVEC的THP-1數量減少［（304±27）個、（294±41）個］，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

各組HUVEC培養上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin水平的比較（表1）：與正常組比較，模型組HUVEC培養上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，通心絡組和人參皂苷Rb1組HUVEC培養上清中MCP-1水平明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

各組THP-1細胞VLA-4、Mac-1、CCR2蛋白表達的比較（圖1、表2）：與正常對照組比較，經HUVEC條件培養基培養后的THP-1上趨化、黏附分子相應受體VLA-4、Mac-1、CCR2蛋白表達增加（P＜0.05）；與模型組比較，通心絡和人參皂苷Rb1 組VLA-4、Mac-1、CCR2蛋白表達減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1　各組HUVEC培養上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1 及E-selectin表達水平的比較（ n=4，±s）

表1　各組HUVEC培養上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1 及E-selectin表達水平的比較（ n=4，±s）

注：HUVEC：人臍靜脈內皮細胞； MCP-1：單核細胞趨化因子；sICAM-1：可溶性細胞間黏附分子1； sVCAM-1：可溶性血管細胞間黏附分子1； E-selectin：E-選擇素。與正常對照組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.01

組別　MCP-1 （pg/ml）sICAM-1 （ng/ml）sVCAM-1 （ng/ml）E-selectin （ng/ml）正常對照組　57.45±2.33　0.22±0.01　2.65±0.37 0.84±0.04模型組　194.80±1.38*2.31±0.07*13.62±0.47*5.66±0.03*通心絡組　93.54±1.61△0.82±0.02△6.03±0.33△2.90±0.03△人參皂苷Rb1組108.16±1.65△0.84±0.03△6.31±0.51△3.09±0.04△

圖1　蛋白免疫印跡法檢測THP-1細胞VLA-4、Mac-1、CCR2蛋白表達

表2　THP-1細胞VLA4、Mac-1、CCR2的蛋白表達的比較（n=3，±s）

表2　THP-1細胞VLA4、Mac-1、CCR2的蛋白表達的比較（n=3，±s）

注：THP-1：白血病單核細胞。VLA4：極遲抗原4 ；Mac-1；巨噬細胞分化抗原-1；CCR2 ：單核細胞趨化因子受體2。與正常對照組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.01

組別　VLA-4　Mac-1　CCR2正常對照組　0.10±0.01　0.09±0.01　0.10±0.02模型組　0.72±0.03*　0.81±0.07*　0.82±0.06*通心絡組　0.10±0.01△　0.11±0.04△　0.13±0.03△人參皂苷Rb1組　0.11±0.01△　0.12±0.04△　0.12±0.01△

3 討論

動脈粥樣硬化以脂質堆積和炎癥細胞在動脈壁聚集形成脂質條紋和粥樣斑塊為特征。體積較小的低密度脂蛋白（LDL）是導致動脈粥樣硬化的最主要脂蛋白顆粒，LDL滲入動脈壁便開始了促進動脈粥樣硬化的形成過程［4］。ox-LDL導致血管內皮細胞功能障礙，活化的血管內皮細胞表達大量的趨化、黏附分子，促進循環血中單核細胞向血管內皮滾動黏附，在趨化信號的作用下遷移進入血管內皮下層吞噬脂質形成脂質條紋的主要成分——泡沫細胞［5］。本實驗中ox-LDL在30 μg/ml時導致HUVEC生存率下降至正常的75%左右，損傷后的HUVEC胞趨化、黏附分子MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin表達增高，與既往研究一致［6］。

趨化、黏附分子在動脈粥樣硬化的發生發展中起重要作用，E-selectin表達于炎癥部位的內皮細胞，可以介導單核細胞在內皮細胞表面最初的滯留和滾動。MCP-1是趨化單核細胞向血管壁滾動的最主要趨化因子，能劑量依賴性的誘導其特異受體CCR2的表達。二者相互作用介導的鈣離子內流，對動脈粥樣硬化炎癥反應過程中單核細胞的遷移和游走及單核細胞的募集極為重要［7］。敲除CCR2或MCP-1基因可阻斷血管緊張素Ⅱ誘導的單核/巨噬細胞浸潤和聚集并減輕動脈粥樣硬化病變［7，8］。ICAM-1/ Mac-1、VCAM-1/VLA-4相互作用介導單核細胞與血管內皮的緊密黏附，并促進單核細胞向內皮下遷移［9］。表達于內皮細胞的ICAM-1、VCAM-1與內膜的泡沫細胞數、動脈粥樣硬化病變程度呈顯著正相關，血中可溶性ICAM-1、VCAM-1是反應動脈粥樣硬化早期變化的指標。用單克隆抗體阻斷的方法或應用P-選擇素，E-selectin，ICAM-1，VCAM-1，VLA-4基因剔除小鼠進行實驗發現，缺乏黏附分子的小鼠給予高脂飲食后誘發的粥樣硬化斑塊與模型組小鼠相比明顯縮小［10］。

本實驗采用ox-LDL造成HUVEC損傷，ox-LDL可明顯增強HUVEC與THP-1細胞的黏附，促進MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin的分泌，經ox-LDL損傷的HUVEC條件培養基對THP-1 CCR2、Mac-1、VLA4蛋白的表達也有上調作用；而通心絡和人參皂苷Rb1干預可以抑制ox-LDL損傷的HUVEC 與THP-1細胞的黏附，減少MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin的分泌，同時減少HUVEC條件培養基培養的THP-1細胞CCR2、Mac-1、VLA4蛋白的表達。以上結果提示，內皮細胞損傷后可以影響THP-1細胞，而通心絡和人參皂苷Rb1作用后可以通過保護HUVEC，減少THP-1細胞的黏附，從而減少巨噬細胞源泡沫細胞，抑制脂質條紋和脂質斑塊的形成，起到抗動脈粥樣硬化作用。

單核細胞與血管內皮細胞的黏附是內皮細胞功能受損而處于激活狀態的表現之一，兩種細胞黏附不僅是物理接觸，而且涉及單核細胞和血管內皮細胞表面諸多分子之間的相互作用，在相互作用過程中兩種細胞的功能均發生相應變化，促進細胞黏附分子的表達，而細胞黏附分子介導的炎癥細胞與血管內皮細胞的黏附及損傷作用則被認為是動脈粥樣硬化重要的始動環節，可作為炎癥活動的指標。此過程涉及多條信號通路的參與，其中血凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）的作用對于ox-LDL損傷HUVEC尤為重要，ox-LDL可濃度依賴性上調LOX-1的表達，通過與內皮細胞表面的LOX-1集合激活內皮，從而影響內皮功能，損傷血管導致動脈粥樣硬化的發生發展［11］。對于通心絡和人參皂苷Rb1是否是通過上述某條或某幾條通路發揮作用，將進行進一步研究。

通心絡膠囊是脈絡學說指導研制的通絡代表方藥，具有血管保護、血液保護、心臟保護三重作用，在臨床心腦血管疾病防治中發揮重大作用。人參是其君藥，有益氣通絡的作用。既往研究表明，通心絡膠囊和人參有保護血管內皮細胞、防治動脈粥樣硬化的作用［12］。本研究通過ox-LDL造成HUVEC損傷模型，與單核細胞共培養，進一步驗證了通心絡及其組方成分人參皂苷Rb1具有保護血管，抑制脈絡瘀阻，發揮抗動脈粥樣硬化的作用。

參考文獻

［1］顧梅，陳娟，汪小樂，等.MTS比色法非小細胞肺癌細胞體外對常用化療藥物的敏感性.中國臨床藥學雜志，2014，23：150-153.

［2］Cho YS，Kim CH，Ha TS，et al.Ginsenoside Rg2 Inhibits lipopolysaccharide-induced adhesion molecule expression in human umbilical vein endothelial cell.Korean J Physiol Pharmacol，2013，17：133-137.

［3］Wang L，Xu Y，Yu Q，et al.H-RN，a novel antiangiogenic peptide derived from hepatocyte growth factor inhibits inflammation in vitro and in vivo through PI3K/AKT/IKK/NF-kB signal pathway.Biochem Pharmacol，2014，89：255-265.

［4］史旭波，胡大一.動脈粥樣硬化性心血管疾病防治中的誤區.中國循環雜志，2014，29：158-160.

［5］Goyal T，Mitra S，Khaidakov M，et al.Current concepts of the role of oxidized LDL receptors in atherosclerosis.Curr Atheroscler Rep ，2012，14：150-159.

［6］Li D，Mehta JL.Antisense to LOX-1 inhibits oxidized LDLmediated upregulation of monocyte chemoattractant protein-1 and monocyte adhesion to human coronary artery endothelial cells.Circulation，2000，101：2889-2895.

［7］徐艷，劉喜平，李琴山，等.CCR2 介導 MCP-1 誘導的人內皮細胞凋亡.中國生物化學與分子生物學報，2010，26：356-361.

［8］阮長耿.血細胞的黏附分子.中國實驗血液學雜志，2004，12：1-5.

［9］Lee ES，Choi JS，Kim MS ，et al.Ginsenoside metabolite compound K differentially antagonizing tumor necrosis factor-a-induced monocyteendothelial trafficking.Chem Biol Interact，2011，194：13-22.

［10］郝群，梁元姣，張承，等.脫氫表雄酮對血管內皮細胞損傷后單核細胞與內皮細胞相互作用的影響.醫學研究生學報，2012，25：571-576.

［11］焦珍珍，方全，黃建鳳.氧化型低密度脂蛋白對正常人外周血單核細胞凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1及尿激酶型纖溶酶原激活劑受體蛋白表達的影響.中國循環雜志，2014，29 ：288-291.

［12］吳以嶺.絡病學.北京：中國中醫藥出版社，2006.198-216.

（編輯：曹洪紅）

基礎與實驗研究

Effect of Dredging Collateral Drug on ox-LDL Injured THP-1 Cells Adhesion to Human Umbilical Vein Endothelial Cells in vitro

LI Hong-rong，WEI Geng，SUN Ying，LI Hui-xin，LIANG Jun-qing，JIA Zhen-hua.
Hebei Medical University，Shijiazhuang （050017），Hebei，China

Abstract

Objective：To observe the effect of oxidative-low density lipoprotein （ox-LDL） injured human leukemia mononuclear cells （THP-1） adhesion to human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） in vitro with the intervening function of dredging collateral drug，tongxinluo （TXL） and ginsenoside （Rb1）.

Methods：Cell injury was induced by ox-LDL treatment.The cells were divided into 4 groups：①Normal control group，②Injury model group，the cells were cultured by ox-LDL，③TXL group，the cells were cultured with both ox-LDL and TXL，④Rb1 group.HUVEC viability was measured by MTS assay，adherence rate of THP-1 cells to HUVECs was tested by vital cell staining.The contents of monocyte chemoat-tractant protein （MCP-1），soluble vascular cell adhesion molecule （sVCAM-1），soluble inter vascular cell adhesion molecule-1 （sICAM-1） and E-selectin in HUVEC conditioned medium were detected by ELISA； protein expressions of CCR2，VLA4 and Mac-1 in THP-1 cells were examined by Western blot analysis.

Results：Compared with Control group，HUVEC viability was decreased in Injury model group （100 ±1.31） % vs（75.57 ± 1.02） %，while increased in both TXL and Rb1 groups （99.25 ± 1.40） % and （99.48 ± 2.15） %； Injury model group showed elevated adherence rate of THP-1 cells to HUVECs，while the adherence rates were reduced in both TXL and Rb1 groups.Compared with Injury model group，TXL group and Rb1 group showed decreased levels of MCP-1，sVCAM-1，sICAM-1 and E-selectin in HUVEC conditioned medium； decreased protein expressions of CCR2，VLA4 and Mac-1 in THP-1 cells.

Conclusion：TXL and Rb1 could protect HUVECs，reduce ox-LDL injury induced vascular endothelial cell adhesion and decrease relevant receptor expression in monocytes； therefore，inhibit injured monocytes adherence to vascular endothelial cells.

Key wordsTongxinluo； Ginsenoside Rb1； Oxidative-low density lipoprotein； Endothelium，vascular； Monocytes

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃 973計劃（2012CB518606）

作者簡介：李紅蓉碩士主要從事中西醫結合心血管病研究Email：hongrongli@126.com通訊作者：李紅蓉

中圖分類號：R541

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）05-0480-04

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.05.015

Corresponding Author：LI Hong-rong，Email：hongrongli@126.com

收稿日期：（2015-08-05）