新疆昌吉地區規模化豬場豬瘟免疫抗體水平檢測與分析

欒廷波伏寅峰，李蓓蓓（1．新疆農一師一團畜牧科，新疆　阿克蘇　84000；.新疆生產建設兵團第七師16團，新疆　奎屯800；.石河子大學動物科技學院，新疆　石河子　8000）

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新疆昌吉地區規模化豬場豬瘟免疫抗體水平檢測與分析

欒廷波1，3，伏寅峰2，李蓓蓓3
（1．新疆農一師一團畜牧科，新疆阿克蘇843000；2.新疆生產建設兵團第七師136團，新疆奎屯833200；3.石河子大學動物科技學院，新疆石河子832000）

摘要：為了掌握昌吉地區5個規模化豬場豬瘟免疫抗體水平的高低及消長規律，同時為養殖戶提供一個科學合理的免疫程序，本試驗選擇昌吉地區5個規模化豬場，收集2012～2013年不同年齡階段的豬血清共1 350份，采用間接ELISA方法檢測其抗體水平并進行分析。經過對昌吉地區5個規模化豬場共1 350份血清采用間接ELISA方法進行了檢測，結果總抗體陽性率為80.07%（1 081/1 350），平均抗體滴度為8log2，標準差為0.856。其中A、B、C、D、E 5個規模化豬場豬瘟抗體陽性率分別為92.22%、82.59%、74.44%、88.51%、62.59%，通過對不同階段豬群抗體陽性率結果統計可知公豬、后備母豬、哺乳母豬、妊娠母豬、7日齡仔豬、14日齡仔豬、21日齡仔豬、30日齡仔豬、40日齡仔豬、55日齡仔豬等不同階段豬群的血清抗體陽性率分別為92%、69%、86%、93%、72%、82%、88.67%、80.67%、72.66%、82.67%。結合檢測結果、臨床生產數據及豬場已采用CSF的免疫程序，建議試驗區仔豬豬瘟免疫程序為23～25日齡進行首免疫，60日齡時進行第二次免疫，生產公、母豬每年春秋兩秋各普免一次，經產母豬每次斷奶前跟胎免疫一次。

關鍵字：豬瘟；ELISA；抗體水平

豬瘟（CSF）又稱經典豬瘟，是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種的急性、烈性、高度接觸性傳染病，給我養豬業帶來了極大的損失，該病具有流行廣泛,發病率高,死亡率高等特點，由于其危害嚴重，所以該病歷來是各國家關注的焦點，1984年世界動物衛生組織（OIE）將該病劃分為A類傳染病，我國作為養豬大國，同時也是豬瘟流行嚴重的國家之一［1-5］,豬瘟病毒目前已成為影響我國養豬業發展的主要傳染病之一。

CSFV在潮濕環境和新鮮的肉食產品中都是非常穩定的［2-10］，但CSFV不耐熱，56℃60 min或60℃10 min即可完全滅活病毒，該病在pH值為5～10范圍內穩定，但在pH值低于3的環境下病毒力會下降，易被高溫、高壓、紫外線、乙醚、甲醛、來蘇兒、燒堿所殺死殺死［3］。

新疆地廣人稀，擁有豐富的土地資源，飼料種類廣泛、產量充裕，養殖成本具有明顯的優勢。根據2004～2008年我國豬瘟國家強制免疫疾病的流行病學數據可知［11-12］，新疆是豬瘟嚴重流行區，豬瘟是我國農業部規定的必須強制免疫的疾病，但是由于新疆的養殖水平與養殖觀念相對落后，疫苗免疫程序的不規范，導致該三種病在新疆時有散在的發生，專家推測該地區的流行之所以這么嚴重，主要跟以下三個原因：一是新疆地區最早為古老的放牧的方式，傳統的養殖觀念根深蒂固，同時新疆地廣人稀，人們接受新理念的機會少，有的養豬場到現在為止還以十幾年前的養殖觀念在養豬。二是新疆和蘇聯蒙古國等鄰近，由于我國建國以前，獸醫管理制度不完善，人們的盲目引種，導致國外許多新的流行病毒株流入新疆。三是國內畜產品和畜禽交易頻發，管理部門管理不嚴格，檢疫檢測技術落后，給該三種病制造了可乘之機。

為了解新疆昌吉地區部分規模化豬場豬瘟抗體水平的高低和消長規律，本研究以昌吉地區部分規模養豬場（母豬＞300頭）為研究對象，采集不同階段的豬群的血清，采用間接ELISA檢測方法對血清抗體進行測定和分析。從而了解該地區豬瘟的抗體水平，為加強和改進免疫措施，有效防控三種疾病的流行，提高養殖效益提供了一定的科學依據。

1　材料與方法

1.1試劑與實驗設備

武漢某動物生物制品公司生產的豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒，預防獸醫實驗室提供自動酶標儀（美國BioTek儀器有限公司），微量移液器（eppendorf公司），恒溫培養箱（北京市光明醫療儀器廠）,無菌操作臺，振蕩器，滅菌高壓鍋，高速離心機等實驗所需儀器設備。

2　實驗樣品

2.1血清樣品的準備

血清：由新疆昌吉地區A、B、C、D、E5個規模化豬場（種母豬＞300頭）共采集血清數共1 350份，采集公豬血清共50份、后備母豬共200份、哺乳母豬共100份、妊娠母豬100份、7日齡仔豬150份、14日齡仔豬150份、21日齡仔豬150份、30日齡仔豬150份、40日齡仔豬150份、55日齡仔豬150份。

2.2樣品采集時間、方法及樣品儲存

血清共分4次均等采集，分別為2012年7月、2012年10月、2013年1月、2013年4月；主要采集方法為前腔靜脈采血法（對與成年豬只個別采取耳緣靜脈采血），血液采集后用高速離心機提取血清即樣品，置于- 20℃冰箱儲存備用。

3　試驗方法與判定

3.1血清稀釋

樣品：按照1:40的體積在血清稀釋板進行稀釋對照:按照1:40的體積分別將陽性對照和陰性對照稀釋

3.2試驗方法步驟

（1）加樣取抗原包被板，將稀釋好的樣品血清和對照血清分別按照100 μL對應從稀釋板轉入抗原包被板中，待檢樣品每份加一個孔，對照樣品每份加2個孔，在振蕩器上微微振勻孔中的樣品，然后置37℃溫育30 min。

（2）洗板甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200 μL，靜置3 min倒掉，再在吸水紙上拍干，共計洗滌5次。

（3）加酶每孔加羊抗豬酶標二抗100 μL，置37℃再溫育30 min。

（4）洗滌同（2）。

（5）顯色每個孔分別加入底物A和B（50 μL）混勻，室溫避光顯色10 min。

（6）終止反應加終止液50 μL利用酶標儀檢測。

3.3結果判定

在酶標儀上測各孔的OD630nm值。試驗成功的條件是陽性對照孔的平均OD630nm值均≥0.8，陰性對照孔的平均OD630nm值均＜0.3。

樣品OD630nm值≥0.35，為陽性；樣品OD630nm值＜0.35，為陰性。

4　數據處理與統計分析

用EXCEL軟件進行原始數據處理，用SPSS11.5對試驗數據進行t檢驗。

5　結果與分析

5.1各豬場CSF血清抗體水平

從表格可以看出（表2）：通過對昌吉地區5個規模化豬場共1350份血清的檢測，結果陽性總數為1 081，陽性率為80.07%，平均OD值為1.121，標準差為0.856，其中A、B、C、D、E5個規模化豬場陽性率分別為92.2%、82.59%、74.44%、88.51%、62.59%、80.07%，各個規模化豬場之間陽性率差異均為極顯著（P≤0.1），其中A場和D場差異不顯著（P≥0.1）,B場和D場差異不顯著（P≤0.1），其他之間差異均為顯著（P≤0.5）。

通過統計可知，A、B、C、D、E各場的OD值分別1.215、0.901、1.115、1.254、0.904、總體OD值為1.121，其中A場和D場差異不顯著（P≥0.1）,B場和D場差異不顯著（P≥0.1），其他之間差異均為顯著（P≤0.5）。

圖1　昌吉地區5個規模化豬場各場CSF血清抗體陽性率

圖2　昌吉地區5個規模化豬場各場CSF血清抗體平均OD值

5.2各豬場CSF不同血清抗體效價水平

從表格（表3）可以看出：抗體效價＜5log2血清數共269份，占總血清數的19.93%，抗體效價為5log2血清數共97份，占總血清數的7.2%，抗體效價為6log2血清數共169份，占總血清數的12.5%，抗體效價為7log2血清共289份，占總血清數的21.4%，抗體效價≥8log2血清數共526份，占總血清數的38.97%。

圖3　不同抗體效價的樣本數及所占比率統計表

5.3不同階段豬群CSF血清抗體水平

從表格（表4）可以看出：公豬、后備母豬、哺乳母豬、妊娠母豬、7日齡仔豬、14日齡仔豬、21日齡仔豬、30日齡仔豬、40日齡仔豬、55日齡仔豬抗體陽性率分別為92%、69%、86%、93%、72%、82%、88.67%、80.67%、72.66、82.67%，通過統計可知各階段的豬群抗體陽性率差異很大，陽性率最高為妊娠母豬和公豬，抗體陽性率最低為后備母豬和40日齡仔豬。從仔豬陽性率結果可以看出，仔豬在7日齡豬瘟抗體陽性率最低為72%，從7日齡到21日齡在逐漸升高，21日齡抗體陽性率最高為88.67%，30日齡抗體陽性率降到最低為72.66%。

表1　CSF血清抗體ELISA檢測與HIA的轉換

表2　昌吉地區5個規模化豬場各場CSF血清抗體水平及陽性率匯總表

表3　不同抗體效價的樣本數及所占比率統計表

表4　昌吉地區5個規模化豬場不同階段豬群CSF血清抗體水平及陽性率匯總表

圖4　昌吉地區5個規模化豬場不同階段豬群血清抗體陽性率

6　分析與討論

6.1各豬場總體檢測結果分析

從結果分析可知，昌吉地區5個規模化豬場共1 350份血清，陽性總數為1 081，該地區的總體陽性率為80.07%，平均OD值為1.121，標準差為0.856。與國家規定的70%水平對比相對較高，血清的整體效價較好，本次結果與馬曉艷等2012年對新疆地區的豬瘟抗體合格率為75.3%結果相近，本次結果顯示豬瘟抗體陽性率比張繼紅等2009利用豬瘟正向間接血凝試驗對新疆地區12個地（州、市）采集的1 749份血清樣品總體免疫合格率為71.3%較高。劉建營等（2012）對廣東地區2012年豬瘟抗體水平進行了檢測，結果顯示廣東地區豬瘟抗體陽性率為76.5%,程漢等（2012）對江蘇泰州地區的豬瘟抗體水平進行檢測，結果顯示陽性率為79.3%。但是部分豬場豬瘟抗體陽性率低于70%，這與豬場防疫管理有不可推卸的責任，應加強豬瘟的免疫抗體水平監測。

圖5　昌吉地區5個規模化豬場不同階段豬群血清抗體平均OD值

6.2不同階段仔豬CSF血清抗體陽性率水平分析

從上圖（圖6）我們可以看出：從仔豬陽性率結果可以看出，仔豬在7日齡豬瘟抗體陽性率最低為72%，從7日齡到21日齡在逐漸升高，21日齡抗體陽性率最高為88.67%，30日齡抗體陽性率降到最低為72.66%。這與曹建等（2012）用HIA法對仔豬母源抗體效價檢測的結果15～21日齡達到最高值，21日齡后逐步降低，于35日齡達到抗體保護臨界值基本相符，結合臨床可知，哺乳初期抗體陽性率有所上升，與母乳中充足的母源抗體有直接關系，但隨著日齡增大，仔豬抗體陽性率降低，斷奶后抗體陽性率急劇降低，都是因為母源抗體攝入不足引起的。經過第一次免疫，仔豬豬瘟抗體陽性率在35～50日齡開始回升。因此在仔豬母源抗體攝入不足時及時進行免疫接種是必要的。

參考文獻：

圖6　不同階段仔豬的CSF血清抗體水平分析

從試驗結果來看，昌吉地區豬瘟免疫后保護力目前比較穩定，達到了國家規定要求，但是有個別豬場免疫效果不理想，這與不健全的防疫制度有很大的關系，通過現場調查可知：昌吉地區豬瘟首免日齡多數在30 d左右，二免日齡在60 d左右。部分豬場進行超前免疫，并于50日齡進行二免。

結合對本次實驗結果的分析與國內外相關文獻報道，對昌吉地區豬瘟免疫程序提出以下建議：后備公、母豬使用前進行兩次豬瘟免疫接種，間隔一個月；生產公、母豬每年春秋兩秋各普免一次；經產母豬每次斷奶前跟胎免疫一次；仔豬23～25日齡進行首免疫，60日齡時進行第二次免疫。

［1］王琴.國內外豬瘟現狀及研究進展.豬瘟病原體檢測與豬瘟綜合防治技術培訓教材,農業部中國獸醫藥品監察所國家豬瘟參考實驗室,2003.

［2］Savi P, Torlone V, Titoli F. Recherches sur la survie duvirus dela peste porcine classique dans certains produits de charcuterie［J］. Bull OIE, 1965, 63:87-96.

［3］Edwards S, Fukusho A, Lefevre P C, et al. Classical swine fever: the global situation［J］. Veterinary microbiology, 2000, 73（2）: 103-119.

［4］Moennig V. The hog cholera virus［J］. Comp Immunol Microbiol Infeet Dis, 1992,15（3）:189-201.

［5］Meyers G, Thiel HJ. MolecμLar characterization of pestivirus［J］. Adv Virus Res, 1996, 47:53-118.

［6］Moormann RJ, van Gennip HG, Miedema GK, et al. Infectious RNA transcribed from an engineered fμLl-length cDNA template of the genome of a pestivirus［J］. J Virol, 1996, 70（2）:763-770.

［7］Ruggli N, Tratschin JD, Mittelholzer C, et al. Nucleotide sequence of classical swine fever virus strainAlfort/187 and transcription of infectious RNA from stably cloned fμLl-length cDNA［J］. J Virol, 1996,70:3478-3487.

［8］王在時,丘惠深,郎洪武.豬瘟病毒野外分離物的研究.豬瘟野毒的分離及初步鑒定.中國獸藥監察所研究報告匯編第14輯,北京.1999,35-38.

［9］劉湘濤,韓雪清,劉伯華等.豬瘟流行野毒Erns基因的序列分析［8］.中國農業科學,2000,33（4）:75-81.

［10］Fritzemeier J, Ritzemeier J, Teuffert JI, et al. Epidemiology of classical swine fever in Germany in thenineties［J］. Vet Microbiol, 2000, 77（1-2）: 29-41.

［11］杜念興，豬瘟的回顧與展望，中國畜禽傳染病，1998（5）：317-319.

［12］韓雪清，劉湘濤，趙啟祖.豬瘟病毒及其豬瘟疫苗研究進展.動物醫學進展，2000，21（2）：1-7.

中圖分類號：S852.65+1

文獻標識碼：A

文章編號：1006- 799X（2015）03- 0040- 04

作者簡介：欒廷波（1984-），男，新疆阿拉爾人，助理獸醫師，主要從事畜牧獸醫工作。