15種水產動物致病菌生長特性及形態特征研究

徐佩，艾克特，周靜文，庹銳，萬晶

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434020)

楊代勤，許巧情

(長江大學動物科學學院，湖北荊州434020；湖北淡水健康養殖協同創新中心，湖北武漢434070)

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15種水產動物致病菌生長特性及形態特征研究

徐佩，艾克特，周靜文，庹銳，萬晶

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434020)

楊代勤，許巧情

(長江大學動物科學學院，湖北荊州434020；湖北淡水健康養殖協同創新中心，湖北武漢434070)

[摘要]采用平板培養及革蘭氏染色鏡檢，對15種水產動物致病菌生長特性及形態特征進行了研究。結果表明，鮰愛德華氏菌只在TSA培養基上能正常生長，而且生長非常緩慢；腐敗希瓦桿菌B16在shieh培養基上能正常生長；其余細菌均能在LB培養基上生長。這些致病菌在形態上可分為3類：一類為球狀菌，包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌和溶壁微球菌；第二類為桿狀菌，包括枯草桿菌、嗜水氣單胞菌B11、鮰愛德華氏菌、遲鈍愛德華氏菌、肺炎克雷伯菌、腐敗希瓦桿菌B16、變形假單胞菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌；第三類為弧狀菌，包括副溶血弧菌和河流弧菌。

[關鍵詞]致病菌；革蘭氏染色；細菌形態

細菌性疾病是魚類中最為常見而且危害較大的一類疾病。隨著養殖事業的發展，養魚規模不斷擴大，以及密養、精養技術的推廣，細菌性疾病也在不斷地暴發流行。如嗜水氣單胞菌能廣泛引起淡水魚類細菌性敗血癥( 溶血性腹水病)，還可引起鱉的紅底板病、穿孔病、出血性腸道壞死癥、癤瘡病以及青蛙的紅腿病等[1]；河流弧菌可使鯉科魚類患出血性敗血癥[2]；熒光假單胞菌可使以草魚為主的多種淡水魚患赤皮病[3]；遲鈍愛德華氏菌可使鰻鱺、羅非魚等海淡水魚患紅疫病愛德華氏病，也能引起池養鱔魚的“紅病”和渠道鲇魚的“氣腫性腐爛病”[4]；鮰愛德華氏菌可使斑點叉尾鮰等患腸道敗血癥[5]；無乳鏈球菌可使多種魚類患鏈球菌病[6]；副溶血弧菌會引起對蝦的紅體病[7]；肺炎克雷伯菌是白鰱鰓絲、鰓耙潰爛病的致病菌，且該菌為強毒株等[8]。這些致病菌嚴重影響漁業的發展，造成了巨大的經濟損失。本研究對15種常見的水產動物致病菌的形態特征進行了染色鏡檢觀察，探討了其生長特性，以期為水產動物細菌性疾病的快速鑒定提供參考。

1材料與方法

1.1材料

無乳鏈球菌、溶壁微球菌和鮰愛德華氏菌3種細菌由中國科學院水生生物研究所李愛華研究員惠贈，遲鈍愛德華氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、枯草桿菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、腐敗希瓦桿菌B16、河流弧菌、嗜水氣單胞菌B11、變形假單胞菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌等購自上海北諾生物科技有限公司。

1.2方法

將金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、溶壁微球菌、遲鈍愛德華氏菌、副溶血弧菌、河流弧菌、表皮葡萄球菌、嗜水氣單胞菌B11、枯草桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、變形假單胞菌、熒光假單胞菌、鮰愛德華氏菌、腐敗希瓦桿菌等細菌的菌株在無菌的環境中分別接種到LB、TSA、sheih瓊脂平板上，在37℃或28℃的培養箱里培養12～24h，觀察菌株的生長情況。

選取在37℃或28℃的培養箱里培養12～24h后具有隆起、光滑、濕潤、圓形的菌落，用劃線的方式接種于LB、shieh或TSA瓊脂平板上，置 37℃或28℃的培養箱里培養18～24h，保存在4℃的環境中備用。將所培養的細菌分別挑取單克隆進行革蘭氏染色后再鏡檢觀察其形態特征。

2結果與分析

金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、溶壁微球菌、枯草桿菌和表皮葡萄球菌均能在LB培養基上正常生長。金黃色葡萄球菌的菌落呈現金黃色，圓形、光滑、濕潤，針尖或米粒大；無乳鏈球菌在營養培養基上生長緩慢，菌落較小，均為白色圓形、表面潤滑光滑、微隆起、邊緣整齊；表皮葡萄球菌的菌落呈現淡黃色，圓形、光滑，有點渾濁；溶壁微球菌、枯草桿菌、肺炎克雷伯菌、變形假單胞菌、DE3、腐敗希瓦桿菌的菌落圓形，表面光滑，微隆起(圖1)。

圖1　5種革蘭氏陽性致病菌在培養基上的生長形態

在LB培養基上能正常生長的革蘭氏陰性致病菌有肺炎克雷伯菌、河流弧菌、嗜水氣單胞菌B11、遲鈍愛德華氏菌、副溶血弧菌、變形假單胞菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌。

鮰愛德華氏菌最佳的培養基TSA培養基，腐敗希瓦桿菌B16最佳的培養基為Shieh培養基。嗜水氣單胞菌在普通營養瓊脂培養基上生長良好，形成邊緣整齊、表面濕潤、隆起、光滑、半透明、灰白色至淡黃色的圓形菌落；遲鈍愛德華氏菌在普通營養瓊脂上呈圓形光滑、較透明或半透明、邊緣整齊、無色或淺灰白色、稍隆起、直徑多在0.5mm(培養48h后多在1.2mm左右)；副溶血弧菌在濃度大的地方, 菌落邊緣不齊, 出現鋸齒狀, 單個菌落圓形、隆起, 表面光滑濕潤, 稍混濁不透明, 不產生色素；河流弧菌在LB 培養基平板上菌落呈圓形，表面光滑、濕潤，邊緣不規則，質地均勻，不透明，呈蠟樣；熒光假單胞菌在普通瓊脂培養基上生長，菌落圓形、邊緣整齊、灰白色、半透明、濕潤，菌落直徑0.5～1.0mm，培養24h后開始產生綠色或黃綠色色素，彌漫培養基。大腸桿菌在營養瓊脂培養基上培養菌株生長 24h 后，形成直徑 2～3mm 邊緣整齊的菌落，菌落圓形、光滑、濕潤、半透明、灰白色、凸起；鮰愛德華氏菌是這些致病菌中較難培養的，在培養基平板上生長較緩慢，常需培養約48h才能形成直徑1～2mm、圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的無色小菌落(圖2)。

圖2　10種革蘭氏陰性致病菌生長狀態

由圖3可看出，金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、溶壁微球菌和枯草桿菌染色鏡檢時顏色為紫色，表明它們屬革蘭氏陽性菌。其中金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌和溶壁微球菌的細菌形態均為球狀而枯草桿菌的形態為桿狀。

圖3　5種革蘭氏陽性致病菌鏡檢形態

由圖4可看出，嗜水氣單胞菌B11、鮰愛德華氏菌、遲鈍愛德華氏菌、肺炎克雷伯菌、腐敗希瓦桿菌B16、變形假單胞菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、副溶血弧菌和河流弧菌染色鏡檢時顏色為紅色，表明它們屬革蘭氏陰性菌。其中嗜水氣單胞菌B11、鮰愛德華氏菌、遲鈍愛德華氏菌、肺炎克雷伯菌、腐敗希瓦桿菌B16、變形假單胞菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌的菌體兩端鈍圓,直形或略彎,革蘭氏陰性短桿菌,單個或成雙存在。而副溶血弧菌，河流弧菌革蘭氏陰性多形態桿菌或稍彎曲弧菌，兩極濃染，無莢膜，無芽孢，有鞭毛。

圖4　10種革蘭氏陰性致病菌鏡檢形態

3討論

本研究對15種常見的水產動物致病菌進行平板培養和革蘭氏染色鏡檢觀察，對其生長特性和形態特征進行了研究，可為快速鑒定水產動物病原菌提供參考。朱芝秀等[9]從患病黃顙魚體分離出菌株，采用PCR方法檢測出致病性嗜水氣單胞菌為其致病菌。譚晶晶等[10]采取菌體形態觀察、生理生化鑒定及16S rRNA基因序列分析等方法從患病奧尼羅非魚中分離病原菌進行鑒定，結果表明，引發海南地區羅非魚暴發性鏈球菌病的主要病原是無乳鏈球菌。張芹等[11]利用生理生化的方法鑒定斑點叉尾鮰的致病

菌株，結果表明鮰愛德華氏菌是其致病菌。徐芊等[12]利用LAMP方法快速地檢測副溶血弧菌，結果表明該方法是檢測副溶血弧菌的有效手段。唐毅等[13]利用細菌生化鑒定了肺炎克雷伯菌，回歸感染試驗結果與自然感染發病的癥狀一致, 初步證實肺炎克雷伯氏菌為白鰱鰓絲、鰓耙潰爛病的致病菌，且該菌為強毒株。與上述鑒定致病菌的方法相比，本研究所用方法具有操作簡單、快速、成本低等特點，適用于廣大養殖戶對水產動物致病菌的快速識別，可為水產動物細菌性疾病診斷提供參考。

[參考文獻]

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[2]黃玉柳,黃國秋,葉欣宇,等.文蛤中1株河流弧菌的分離·鑒定以及藥敏試驗[J]安徽農業科學,2012,40(9):5234～5242.

[3]鄧顯文,謝芝勛,劉加波，等.羅非魚熒光假單胞菌的分離鑒定[J].廣西農業科學,2010,41(6):612～615.

[4]陳翠珍.愛德華氏菌及魚類愛德華氏菌病(綜述)[J].河北科技師范學院學報,2004,18(3):70～75.

[5]張芹,宋威,陳杰.斑點叉尾鮰鲇魚愛德華氏菌的分離與鑒定[J].安徽農業科學,2010,38(35):20121～20122.

[6]盧邁新,黎炯,葉星，等.廣東與海南養殖羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定與特性分析[J].微生物學通報,2010,37(5):766～774.

[7]藺紅蘋,邱德全,譚龍艷.一株副溶血弧菌的分離和鑒定[J].水產科學,2007,26(5):296～299.

[8]唐毅,張芬,孫翰昌,等.白鰱肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].西南大學學報,2007,29(6):74～76.

[9]朱芝秀,鄧舜洲,楊竹青，等.致病性嗜水氣單胞菌PCR快速檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫,2012,39(12):40～44.

[10]譚晶晶.奧尼羅非魚無乳鏈球菌的鑒定及免疫預防的初步研究[D].武漢：華中農業大學,2011.

[11]張芹,宋威,陳杰.斑點叉尾鮰鲇魚愛德華氏菌的分離與鑒定[J].安徽農業科學,2010,38(35):20121～20122.

[12]徐芊,孫曉紅,趙勇，等.副溶血弧菌LAMP檢測方法的建立[J].中國生物工程雜志,2007,27(2):66～72.

[13]唐毅,張芬,孫翰昌，等.白鰱肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].西南大學學報,2007,29(6):73～76.

[收稿日期]2015-08-06

[基金項目]長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心開放基金項目;湖北省新農村發展研究院開放基金項目(2013CXJ08);湖北省公益性科研基金項目 (2012DBA29001)。

[作者簡介]徐佩(1989-)，女，碩士生，研究方向為魚類疾病。通信作者：許巧情，xuqiaoqing@yangtzeu.edu.cn。

[中圖分類號]S917.1；S941.42

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)09-0026-03

[引著格式]徐佩，艾克特，周靜文，等.15種水產動物致病菌生長特性及形態特征研究[J].長江大學學報(自科版) ，2016，13(9)：26～28,37.