黃鱔白頭病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

曾明華

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

張治平

(湖北省荊州市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，湖北 荊州434000)

高帥，莊健

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

楊代勤

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州434025)

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黃鱔白頭病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

曾明華

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

張治平

(湖北省荊州市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，湖北 荊州434000)

高帥，莊健

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

楊代勤

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州434025)

[摘要]對患白頭病黃鱔(Monopterus albus)的肝和腎進(jìn)行了常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查以及病原菌的形態(tài)觀察和生理生化特性分析，結(jié)果表明：該病原菌為溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)?；貧w感染試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：該菌株對頭抱曲松、氟哌酸、復(fù)方新諾明3種藥物高度敏感，對氧氟沙星、氨芐西林、乙酰螺旋霉素、四環(huán)素、青霉素、強(qiáng)力霉素6種藥物耐藥。因此，頭抱曲松、氟哌酸和復(fù)方新諾明應(yīng)作為治療此病的備選藥物。

[關(guān)鍵詞]黃鱔 (Monopterus albus)；白頭病；溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)；藥敏試驗(yàn)

白頭病是危害黃鱔的細(xì)菌病之一，主要在引種后的15d內(nèi)發(fā)生，黃鱔身體受傷后繼發(fā)性感染，有傳染快、死亡率高等特點(diǎn)，每年給黃鱔養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。楊代勤[1]首次報(bào)道了黃鱔白頭病的發(fā)生，其癥狀為吻部前端發(fā)炎，顏色發(fā)白，病鱔離群，頭部常伸出水面，活力較弱。溫和氣單胞菌屬單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種常見的條件性致病菌。已報(bào)道可感染的水產(chǎn)動(dòng)物有金魚[2]、異育銀鯽[3]、斑點(diǎn)叉尾鮰[4]、黃沙鱉[5]等。該菌也可引起人類食物中毒和敗血癥等[6]，是人魚共患的病原菌。本研究通過常規(guī)鑒定方法對致病菌進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以期為該病的防治提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

患病黃鱔采自長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院黃鱔研究所，體長25～30cm，體重(50.80±5.22)g。主要癥狀為：黃鱔頭部及其下層肌肉出現(xiàn)紅斑，周圍組織成黑色，尾、頭或腹部可見皮膚發(fā)白潰瘍，重者潰瘍爛穿露出骨骼和內(nèi)臟，伴有紅腫出現(xiàn)。健康黃鱔由長江大學(xué)動(dòng)科院黃鱔研究所提供，體重(50.30±2.60)g，體質(zhì)健壯無病癥，試驗(yàn)前水族箱暫養(yǎng)7d。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌的分離純化

取發(fā)病癥狀典型的黃鱔，無菌操作條件下從病鱔肝和腎等取樣，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)24h。待平板上長出形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落后，挑選單個(gè)優(yōu)勢菌落再次劃線分離,28℃培養(yǎng)24h后經(jīng)過多次純化獲得純培養(yǎng)的菌株，并轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2分離株的鑒定

將菌落接種于微生物生化鑒定管中，28℃恒溫培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。各項(xiàng)生理生化試驗(yàn)按中國科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組[7]的方法進(jìn)行生化測試，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]的方法進(jìn)行鑒定。

1.2.3回歸感染試驗(yàn)

1)注射感染無菌生理鹽水稀釋純化的菌落，采用分光光度計(jì)將濃度調(diào)節(jié)為3.0×106CFU/mL、3.0×107CFU/mL、3.0×108CFU/mL。取健康黃鱔30尾，腹腔注射菌懸液，每個(gè)濃度注射10尾，劑量均為0.lmL/尾，取同樣大小的健康黃鱔10尾，同樣注射無菌生理鹽水(pH7.2)為對照組。感染組、對照組置于不同水族箱中，于25℃水溫下飼養(yǎng)，每天觀察發(fā)病與死亡情況，并對瀕死的黃鱔及時(shí)進(jìn)行剖解和致病原菌的分離鑒定。以被感染黃鱔出現(xiàn)同自然病例同樣的病變、從感染發(fā)病黃鱔中重新分離到原感染菌作為相應(yīng)致病菌的判定指標(biāo)。致病性的結(jié)束時(shí)間以不再發(fā)生死亡為止。

2)浸泡感染取暫養(yǎng)7d后的健康黃鱔采用2種方式浸浴感染。一種人為創(chuàng)傷感染，即先用無菌刀片劃破黃鱔體側(cè)皮膚后放入濃度為3.0×106、30×107、3.0×108CFU/mL的菌懸液中浸??；另一種將未損傷皮膚的黃鱔作同樣浸浴。每組10尾，浸浴2h后轉(zhuǎn)入不同水族箱內(nèi)飼養(yǎng)并正常管理，致病性試驗(yàn)的結(jié)果觀察與分析方法同上。

1.2.4藥敏試驗(yàn)

將28℃培養(yǎng)24h的菌苔用無菌生理鹽水調(diào)成菌懸液后，取0.lmL均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，然后貼上藥物敏感試紙，恒溫28℃培養(yǎng)24h后，觀察并記錄抑菌圈有無及直徑大小，根據(jù)其抑菌圈直徑判斷菌株對藥物的敏感性結(jié)果。檢測標(biāo)準(zhǔn)為直徑d>25mm高度敏感；15mm

2結(jié)果與分析

表1　所分離菌株的生化特性

注：表中符號(hào)“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.1病原菌的分離鑒定

2.1.1分離菌的形態(tài)特征

從病鱔的肝、腎臟中分離到一疑似致病菌株，命名為hs-1菌。該病菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上能正常生長，菌落呈圓形、邊緣整齊、中央微隆起、半透明。

革蘭氏染色后，觀察可見：革蘭氏陰性、單極生鞭毛、無芽孢、兩端鈍圓、單個(gè)或2個(gè)相連排列、大小多在(0.4～1)μm×(1.0～2.0)μm的桿狀。

2.1.2分離菌的生理生化特性

分離菌的生理生化鑒定結(jié)果見表1。由表1可見，該菌氧化酶、甘露醇和運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)為陽性，乳糖、水楊苷試驗(yàn)為陰性。生理生化特征與溫和氣單胞菌基本相同。

2.2感染試驗(yàn)

2.2.1注射感染

表2結(jié)果表明，hs-1對黃鱔有致病性，用3.0×106CFU /mL劑量攻擊，黃鱔能長時(shí)間存活，只有少數(shù)表現(xiàn)為輕微出血；用3.0×107CFU /mL劑量攻擊，黃鱔在3d死亡率達(dá)30%；其余黃鱔至試驗(yàn)結(jié)束除出現(xiàn)體表輕微出血，食量下降外均無明顯癥狀。用3.0×108CFU /mL劑量攻擊，黃鱔在3d死亡率為100%。試驗(yàn)中觀察到，攻毒在24h內(nèi)急性死亡的黃鱔除了在肝臟、腎臟中能分離到大量攻擊菌外，發(fā)病癥狀并不明顯，而在攻毒2d后發(fā)病的魚才出現(xiàn)體表潰瘍、腹腔大量腹水、肝臟變黑等典型自然發(fā)病癥狀。從病鱔肝臟、腎臟中分離到的致病菌與原分離菌株在菌落形態(tài)，生理生化特性方面基本相同。對照組無癥狀和無死亡。

表2　腹腔注射感染試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2浸泡感染

由表3可見，浸泡感染試驗(yàn)中，創(chuàng)傷感染組比未創(chuàng)傷感染組死亡率明顯高，且發(fā)病黃鱔出現(xiàn)的癥狀與自然發(fā)病癥狀也基本相似；對照組無癥狀、無死亡。分離菌株在人工浸泡試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，能使健康黃鱔出現(xiàn)和自然病鱔相似的癥狀。試驗(yàn)中觀察到，攻毒在24h內(nèi)急性死亡的黃鱔除了在肝臟、腎臟中能分離到大量攻擊菌外，發(fā)病癥狀并不明顯，而在攻毒2d后發(fā)病的魚才出現(xiàn)體表潰瘍、腹腔大量腹水、肝臟變黑等典型自然發(fā)病癥狀。從病鱔肝臟、腎臟中分離到的致病菌與原分離菌株在菌落形態(tài)、生理生化特性方面基本相同。對照組無癥狀、無死亡。

表3　 黃鱔浸泡感染試驗(yàn)結(jié)果

表4　分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3藥敏試驗(yàn)

分離菌株對15種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：該病原菌對頭孢曲松、氟哌酸、復(fù)方新諾明3種藥物高度敏感；對氯霉素、新霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、紅霉素6種藥物中度敏感；對氧氟沙星、氨芐西林、乙酰螺旋霉素、四環(huán)素、青霉素、強(qiáng)力霉素6種藥物敏感低。各種藥物對該菌株的抑菌圈數(shù)據(jù)見表4。

3討論

1)本研究對典型患白頭病的黃鱔進(jìn)行病原菌的分離后，經(jīng)過形態(tài)特征和生理生化特性分析，初步鑒定為溫和氣單胞菌。溫和氣單胞菌是一種條件致病菌，廣泛分布在自然界中，主要致病因子是產(chǎn)生各種溶血毒素與腸毒素[3]。溫和氣單胞菌能引起多種動(dòng)物發(fā)病，我國已從斑點(diǎn)叉尾鮰[4]、黃沙鱉[5]、黃顙魚[9]和異域銀鯽[3]等水生動(dòng)物體內(nèi)分離到此菌。在夏季高溫季節(jié)，黃鱔苗種以水蚯蚓作為餌料時(shí)，可能由于水蚯蚓處理不干凈，該菌由水蚯蚓帶入而導(dǎo)致幼鱔發(fā)病[10]。預(yù)防時(shí)應(yīng)做好餌料的消毒，防止病原菌的帶入。

2)通過回歸感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hs-1具有較強(qiáng)的致病力。細(xì)菌濃度為3.0×106CFU/mL時(shí)，只對有外傷的黃鱔有感染力；當(dāng)濃度達(dá)到3.0×107CFU/mL時(shí)，試驗(yàn)組均有感染，且濃度越高，發(fā)病越快，死亡率也越高；有創(chuàng)傷的黃鱔比無傷的黃鱔發(fā)病快，死亡率高；注射感染與浸泡感染無明顯差異。由此可見，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降和病原菌大量繁殖時(shí)會(huì)引起黃鱔發(fā)病死亡。因此，在黃鱔放養(yǎng)前應(yīng)對水體及網(wǎng)箱消毒，網(wǎng)箱提前浸泡，防止刮傷黃鱔體表；養(yǎng)殖過程中，應(yīng)及時(shí)清除殘餌，勤換水，保持良好的水質(zhì)，管理好水草，規(guī)范操作，以免黃鱔受傷。

3)溫和氣單胞菌不同的分離株對藥物的敏感性有差異。如蘇應(yīng)兵等[11]從出血病的斑點(diǎn)叉尾鮰中分離的溫和氣單胞菌對復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氟哌酸和卡那霉素高度敏感，而對廣譜抗生素氨芐青霉素、青霉素、先鋒霉素Ⅵ和紅霉素等均有耐藥性。蔡完其等[12]從羅非魚中分離出的溫和氣單胞菌對丁胺卡那霉素、慶大霉素、多粘菌素B、妥布霉素、氟哌酸和氯霉素等抗生素敏感。馬有智等[13]從背腹甲及四肢出現(xiàn)癤瘡病、裙邊糜爛的患病鱉的心、肝臟中分離到的溫和氣單胞菌對菌必治、頭孢氨噻肟和頭袍羧甲噻肟高度敏感，而對四環(huán)素、麥迪霉素、氨芐青霉素、青霉素、妥布霉素、萬古霉素和潔霉素等不敏感。劉敏等[14]從患皮膚潰爛的鯉魚皮膚病灶處和肝臟組織分離到溫和氣單胞菌對左氧氟沙星、氟哌酸、利福平、環(huán)丙沙星、白霉素高度敏感。

魚的種類、魚體的機(jī)能狀況及環(huán)境因素都可能會(huì)影響細(xì)菌的毒力和表現(xiàn)，這可能是導(dǎo)致溫和氣單胞菌不同的分離株對藥物有不同敏感性的原因。在實(shí)際生產(chǎn)中，藥物種類的選擇和劑量的確定還受到養(yǎng)殖環(huán)境、藥物作用機(jī)理、藥物使用頻率、疾病嚴(yán)重程度等因素制約。本研究認(rèn)為，從患白頭病的黃鱔中分離到的溫和氣單胞菌對頭抱曲松、氟哌酸、復(fù)方新諾明3種藥物高度敏感；對氯霉素、新霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、紅霉素6種藥物中度敏感；對氧氟沙星、氨芐西林、乙酰螺旋霉素、四環(huán)素、青霉素、強(qiáng)力霉素6種藥物敏感程度低，可作為生產(chǎn)用藥的參考。此外，黃鱔體表潰瘍病與環(huán)境條件也有很大關(guān)系。因此，當(dāng)該病發(fā)生后，在對該病經(jīng)行藥物治療的同時(shí)，控制水質(zhì)和環(huán)境都是十分重要的。

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[收稿日期]2015-06-03

[基金項(xiàng)目]湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BBA235)；湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(T201503)。

[作者簡介]曾明華(1990-)，男，碩士生，研究方向?yàn)槊厮a(chǎn)養(yǎng)殖。通信作者：楊代勤，yangdaiq@163.com。

[中圖分類號(hào)]S941.42

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)09-0029-04

[引著格式]曾明華,張治平,高帥，等.黃鱔白頭病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(9)：29～32.