黃鱔出血病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

莊健

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

張治平

(湖北省荊州市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，湖北 荊州 434000)

曾明華，高帥

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

楊代勤

長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025

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黃鱔出血病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

莊健

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

張治平

(湖北省荊州市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，湖北 荊州 434000)

曾明華，高帥

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

楊代勤

長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025

[摘要]通過(guò)對(duì)患出血病黃鱔(Monopterus albus)的血液進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查、病原菌的形態(tài)觀察及生理生化特性分析，結(jié)果表明：該病原菌為嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila) 。回歸感染試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：該病原菌對(duì)四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星和強(qiáng)力霉素高度敏感，對(duì)青霉素、安卡西林、頭孢菌素耐藥，對(duì)妥布霉素、新霉素、氧氟沙星、多粘菌素、慶大霉素、克林霉素、卡那霉素、先鋒霉素Ⅵ號(hào)和紅霉素、復(fù)方新諾明呈現(xiàn)出不同程度的敏感性。因此，四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星和強(qiáng)力霉素可作為治療此病的備選藥物。

[關(guān)鍵詞]黃鱔 (Monopterus albus)；出血病；嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

黃鱔出血病又稱(chēng)出血性敗血癥，俗稱(chēng)“赤斑病”、“打印病”，是黃鱔養(yǎng)殖中常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病，從早春至10月底均可發(fā)生，此病流行廣，發(fā)展快，死亡率高。陳懷青等[1]首次報(bào)道了此病病原菌為嗜水氣單胞菌。之后，沈錦玉等[2]通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖黃鱔的肝、腎分離的細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定，得到了類(lèi)似的結(jié)果。而杭州地區(qū)從患出血病黃鱔體內(nèi)分離得到病原菌，經(jīng)鑒定為產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)[3]和溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)[4]。為了給黃鱔出血病的防治提供參考依據(jù)，本研究對(duì)該病病原菌進(jìn)行了分離鑒定、人工感染試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用黃鱔由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院黃鱔研究所提供。

1.2方法

1.2.1菌株分離

選取自然發(fā)病且出血病癥狀明顯的病鱔，用75%的酒精對(duì)病鱔體表進(jìn)行消毒，解剖無(wú)菌取樣采集病鱔的血液，劃線(xiàn)接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。28℃恒溫培養(yǎng)24h后，隨機(jī)挑選特征鮮明的單菌落作純化培養(yǎng)。細(xì)菌分離純化方法按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]和《獸醫(yī)微生物生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)》[6]的方法進(jìn)行。將純化后的菌株分離，接種到瓊脂斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原菌的鑒定

純培養(yǎng)菌株經(jīng)20h 斜面培養(yǎng)后作革蘭氏染色，然后進(jìn)行菌落、菌體形態(tài)觀察，并移植于普通肉湯中進(jìn)行生長(zhǎng)特性觀察。生理生化反應(yīng)測(cè)定及細(xì)菌鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]中的方法進(jìn)行。

1.2.3回歸感染試驗(yàn)

選取規(guī)格一致的健康黃鱔，平均體重(100±5)g/尾。在室內(nèi)暫養(yǎng)1周隨機(jī)分組后，進(jìn)行試驗(yàn)。將分離到的細(xì)菌接種于新鮮營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，28℃恒溫培養(yǎng)16～18h后，用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液，用比濁法將菌懸液細(xì)菌濃度稀釋為1×106CFU/mL。選取10尾健康黃鱔，按0.5mL/尾腹腔注射菌懸液，對(duì)照組注射等量生理鹽水。試驗(yàn)期間保持水溫24～26℃，觀察記錄黃鱔的發(fā)病情況。對(duì)發(fā)病黃鱔進(jìn)行病原菌的分離純化并進(jìn)行鑒定。

1.2.4藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片法檢測(cè)。調(diào)制濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，均勻涂布在瓊脂平板上，貼上藥敏紙片。具體操作及結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[6,8]的方法進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離鑒定

注：P為陽(yáng)性；N為陰性。

表3　黃鱔感染試驗(yàn)

分離得到的病原菌經(jīng)純培養(yǎng)，菌落的形態(tài)特征見(jiàn)表1。菌落呈圓形，微凸，表面光滑，邊緣整齊，半透明。分離菌株為革蘭氏染色陰性短桿菌，菌體直，兩端鈍圓，無(wú)莢膜，無(wú)芽胞，多數(shù)單個(gè)存在，少數(shù)成雙排列。極生單鞭毛，有運(yùn)動(dòng)性。

根據(jù)上述待測(cè)菌株形態(tài)、培養(yǎng)特性及表2體現(xiàn)的生理生化特性測(cè)定結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]可知，該菌株與嗜水氣單胞菌基本一致，故認(rèn)為待測(cè)菌株應(yīng)為嗜水氣單胞菌。

2.2回歸感染試驗(yàn)

由表3可以看出，將分離得到的純種病原菌注射于健康黃鱔腹腔，10尾黃鱔在3d內(nèi)全部發(fā)病死亡，死亡率100%，并出現(xiàn)與自然發(fā)病的出血病黃鱔同樣的病癥，對(duì)照組健康無(wú)死亡。從發(fā)病黃鱔體內(nèi)分離得到同樣的菌種，而對(duì)照組沒(méi)有分離出該病原菌。證明該嗜水氣單胞菌分離株是黃鱔出血病的病原菌，具有較強(qiáng)的致病力。

2.3藥敏試驗(yàn)

分離菌對(duì)17種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出：該株病原菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、諾氟沙星和強(qiáng)力霉素等4種藥物高度敏感，對(duì)妥布霉素、新霉素、氧氟沙星、多粘菌素、慶大霉素、克林霉素、卡那霉素、先鋒霉素Ⅵ號(hào)、紅霉素和復(fù)方新諾明表現(xiàn)出不同程度的敏感性，對(duì)青霉素、安卡西林、頭孢菌素等3種藥物耐藥。

表4　 分離菌株對(duì)各種藥物的敏感性

注：H表示高度敏感；M表示中度敏感；F表示不敏感。

3討論

目前我國(guó)報(bào)道的黃鱔出血病的病原菌有嗜水氣單胞菌[1,2,9,10]、產(chǎn)堿假單胞菌[3]和溫和氣單胞菌[4]。本研究從長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院黃鱔水產(chǎn)研究所患出血病的黃鱔中分離得到的病原菌，經(jīng)初步鑒定為嗜水氣單胞菌，與陳懷青等[1]的試驗(yàn)結(jié)果相似。嗜水氣單胞菌在自然界尤其是在水中廣泛分布，為正常共棲菌，是一種條件致病菌，是人、獸、魚(yú)共患病病原[11]。當(dāng)養(yǎng)殖水體水質(zhì)惡化、餌料營(yíng)養(yǎng)不良或外傷出現(xiàn)時(shí)，均可導(dǎo)致該病的暴發(fā)[12]。有研究認(rèn)為湖北環(huán)毛蚓是其原發(fā)性的致病因子[9]。因此，黃鱔養(yǎng)殖過(guò)程中引種要嚴(yán)格把關(guān)，選擇健康優(yōu)質(zhì)的苗種篩選和暫養(yǎng)觀察，剔除弱殘苗種，放養(yǎng)前對(duì)鱔體消毒；高溫季節(jié)確保水源穩(wěn)定，種植水草，定期對(duì)水體消毒，改善水質(zhì)條件；日常投喂過(guò)程中，尤其是餌料中加環(huán)毛蚓的，應(yīng)定期拌內(nèi)服藥投喂，增強(qiáng)黃鱔的抵抗力；減少不規(guī)范的操作對(duì)黃鱔造成的傷害；加強(qiáng)日常觀察，早發(fā)現(xiàn)早治療。

本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：該株病原菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、諾氟沙星和強(qiáng)力霉素等4種藥物高度敏感，對(duì)妥布霉素、新霉素、氧氟沙星、多粘菌素、慶大霉素、克林霉素、卡那霉素、先鋒霉素Ⅵ號(hào)、紅霉素和復(fù)方新諾明表現(xiàn)出不同程度的敏感性，對(duì)青霉素、安卡西林、頭孢菌素等3種藥物耐藥。與陳懷青等[1]、何智[13]、彭彬等[12]和高明輝等[14]報(bào)道的嗜水氣單胞菌對(duì)氯霉素、諾氟沙星等高度敏感，對(duì)青霉素、氨芐西林等耐藥的特征相符。而對(duì)多粘菌素、復(fù)方新諾明和四環(huán)素類(lèi)藥物的敏感性各地情況不一。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，要根據(jù)具體情況合理地選用藥物，以期用最小的成本達(dá)到最佳的防治效果，使養(yǎng)殖利益最大化。

[參考文獻(xiàn)]

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[收稿日期]2015-06-03

[基金項(xiàng)目]湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BBA235)；湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(T201503)。

[作者簡(jiǎn)介]莊健(1987-)，男，碩士生，研究方向?yàn)樘胤N水產(chǎn)養(yǎng)殖。通信作者：楊代勤，yangdaiq@163.com。

[中圖分類(lèi)號(hào)]S941.42

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)03-0023-03

[引著格式]莊健，張治平，曾明華，等.黃鱔出血病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(3)：23～25.