無創性遠隔肢體缺血后適應對大鼠急性腦缺血的影響

常莉莎，張云鶴，彭延波，張　江*，王大力

(華北理工大學附屬醫院 1.神經內二科;2.神經外科，河北 唐山063000)

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*通訊作者

無創性遠隔肢體缺血后適應對大鼠急性腦缺血的影響

常莉莎1，張云鶴2，彭延波1，張江1*，王大力1

(華北理工大學附屬醫院 1.神經內二科;2.神經外科，河北 唐山063000)

摘要：目的探討無創性遠隔肢體缺血后適應對大鼠急性腦缺血的保護作用及機制。方法54只雄性SD大鼠隨機分為3組，每組18只：假手術組(sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、遠隔肢體缺血后適應組(RPC組)，比較3組大鼠神經功能缺損評分、腦含水量、腦梗死體積、海馬CA1區細胞形態學變化和凋亡細胞水平。結果與I/R組比較，RPC組腦缺血再灌注損傷減輕，神經缺損評分降低，腦含水量減少，腦梗死體積減小，錐體細胞損傷明顯減輕，退變神經元明顯減少，凋亡水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論無創性遠隔肢體缺血后適應在缺血性腦血管病急性期具有神經保護作用，其機制可能是通過降低神經細胞凋亡水平來實現的。

關鍵詞：腦缺血；肢體缺血后適應；凋亡；無創性

(ChinJLabDiagn,2016,20:0700)

由于遠隔缺血后適應可以通過對肢體等不重要部位進行干預，具有事后性，具有較好的臨床應用前景，成為近年研究的熱點。已有研究表明遠隔缺血后適應能對心肌[1]、腎臟[2]、骨骼肌[3]及腦[4]產生缺血保護作用，但尚無定論。本文通過制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)線栓模型，初步探討無創性遠隔肢體缺血后適應(remote ischemic postconditioning，RPC)是否對大鼠急性期腦缺血損傷具有保護作用，并探討其機制。

1材料與方法

1.1主要試劑

主要試劑：Hs-CRP多克隆抗體，購自北京博奧森生物有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒，購自北京博奧森生物有限公司；多聚甲醛，購自天津市奧淇醫科醫藥銷售有限公司；10%水和氯醛，購自天津歐博凱化工有限公司。

1.2實驗動物及分組

SPF級成年健康雄性SD大鼠54只，體重260-280 g，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物使用許可證編號：SCXK(京)2009-0004。采用抽簽法將大鼠隨機分為3組，每組18只：(1)假手術組(sham組)：單純暴露頸部血管，不行缺血操作，不給予后適應干預。(2)缺血2 h再灌注組(I/R組)：大鼠MCAO 2 h進行長時間再灌注。(3)無創性肢體缺血后適應組(RPC)：大鼠MCAO 2 h后于魚線拔出的同時立即給予無創性遠隔肢體缺血后適應。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型制作對Longa線栓法[5]進行改良建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。判定模型：動物麻藥失效蘇醒后出現Horner征(缺血側出現眼瞼閉合、同側眼球下陷等)和左側肢體癱瘓的癥狀。死亡動物及造模不成功的大鼠重新造模保證每組大鼠數量不變。

1.3.2無創性肢體缺血后適應干預方法用止血帶結扎大鼠雙側下肢根部結扎10 min、放松10 min，進行3個循環，以不能觸摸到股動脈搏動為結扎股動脈缺血成功。

1.4觀測指標

3組大鼠于MCAO模型建立后缺血2 h再灌注24 h后按Zea-Longa[5]等級評分法行神經功能評分，然后處死大鼠，采用TUNEL法測凋亡細胞水平，干濕稱重法檢測腦含水量，HE染色光鏡觀察細胞形態學，TTC染色法、數碼相機拍照、Adobe PhotoShop CS軟件分析、計算腦梗死體積。

1.5統計學方法

2結果

2.13組大鼠神經功能缺損的比較Sham組未見到神經功能受損，I/R組與Sham組組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；RPC組與I/R組比較，評分降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　3組大鼠神經功能缺損評分的比較±s)

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

2.23組大鼠局灶性腦缺血后腦水含量的比較局灶性腦缺血再灌注后I/R組和RPC組腦組織的含水量較Sham組都明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；但與I/R組比較，RPC組腦組織的水含量明顯少，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2　3組大鼠腦缺血再灌注后腦水含量的比較±s)

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

2.33組大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的比較Sham組的腦梗死體積為0，與I/R組的腦梗死體積比較，RPC組腦梗死體積減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2　3組大鼠TTC染色腦梗死體積的比較

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

2.43組大鼠HE染色法光鏡下海馬CA1區細胞退變神經元數量的比較與Sham組比較I/R組的退變神經元數量最多，RPC組與I/R組比較，錐體細胞損傷明顯減輕，退變神經元數量減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4　　　3組大鼠HE染色海馬CA1區細胞退變神經元數的

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

2.53組大鼠TUNEL法檢測海馬CAI區神經元凋亡數量的比較與Sham組比較，I/R組的凋亡細胞陽性數量最多，RPC組與I/R組比較，凋亡細胞陽性數量減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5　　　3組大鼠TUNEL法檢測海馬CAI區神經元凋亡的

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

3討論

已有研究證實缺血后適應[6]也能產生缺血耐受，但要使已缺血區域的腦組織原位再缺血來觸發缺血后適應，臨床應用顯然不現實。尤其是大腦對缺血的敏感性及神經系統缺血后不可逆的損傷，患者難以接受，臨床醫生難以操作，使得腦組織原位缺血后適應的研究不能用于臨床。遠隔缺血后適應[7]是指器官缺血后，對遠隔器官進行短暫的輕度的缺血再通，可起到保護作用。四肢由于對缺血耐受性強，容易實施缺血適應操作，對四肢進行短暫缺血再灌注[12]來探討對腦缺血保護是一種比較安全有效的治療措施?；诖宋覀兺ㄟ^無創性間斷性阻斷大鼠雙側股動脈缺血刺激，觀察無創性遠隔肢體缺血后適應是否能夠增強腦對缺血再灌注損傷的抵抗能力，為臨床救治缺血性腦血管病提供新的思路和手段。

由于SD大鼠腦血管解剖和生理功能與人類高度相似，所以我們在實驗中利用Longa改良線栓法建立了穩定的大鼠大腦中動脈模型。采用無創性遠隔缺血后適應(止血帶短暫阻斷雙側下肢血流10 min/10 min、3個循環)的方法進行研究，3組大鼠均于再灌注后24 h處死，從神經行為學、腦水腫程度、HE染色病理改變、神經元凋亡水平及炎癥反應等方面進行了研究比較。目前關于此方面的研究尚存有爭議，如2007年，Zhao等[8]研究認為缺血后適應可以保護全腦缺血動物海馬CAI區的神經元，但不能改善其神經行為學測試情況，并說明盡管梗死體積減少但并不意味著神經功能改善。但王貝娜等[9]采用短暫肢體缺血后適應，發現可以顯著改善神經功能。同期，王麗華等[10]對遠程缺血后適應進行研究發現NIHSS評分明顯改善。我們的研究證實了無創性遠隔缺血后適應組與缺血再灌注組比較可以明顯減少腦缺血側腦梗死體積，減輕腦水腫，同時改善神經功能評分，對急性腦缺血具有保護作用。關于其腦保護作用的機制我們從凋亡方面進行了進一步研究。

細胞凋亡是多細胞有機體為調控機體發育，維護內環境穩定，由基因控制的細胞主動死亡過程。Zhao等[8]在大鼠局灶性缺血模型中，發現缺血后處理能顯著減少缺血半暗帶區凋亡細胞的數量。Xing等[11]發現缺血后適應通過抑制凋亡，保護神經元免受缺血再灌注損傷。我們在實驗中通過HE染色發現缺血再灌注組海馬CAI區神經元均失去正常結構，細胞排列松散，結構紊亂，錐體細胞明顯減少，可觀察到大量退變神經元。而無創性遠隔缺血后適應組與之比較凋亡細胞數減少，程度有所減輕。同時通過TUNEL染色發現缺血再灌注組海馬CAI區神經元錐體細胞發生萎縮、結構破壞，細胞漿出現深染、空泡損害，細胞核出現固縮、碎裂、溶解，可見到典型的凋亡小體。而無創性遠隔缺血后適應組與之比較神經元細胞損傷程度均明顯減輕，凋亡神經元數也顯著降低。提示無創性遠隔缺血后適應通過抑制神經元凋亡發揮神經保護作用。

本實驗證實了無創性遠隔肢體缺血后適應在缺血性腦血管病急性期具有神經保護作用，其機制可能是通過降低凋亡水平來實現的。由于其實施具有無創、易行、易接受性的優點，更容易實現基礎研究向臨床應用的轉化，具有廣泛的臨床應用前景。

參考文獻：

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[2]冷玉芳,姚愛軍.肢體缺血后處理和腎臟缺血后處理對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的影響[J].臨床麻醉學雜志,2009,25(11):974.

[3]Eberlin,Kyle R,McCormack,Michael C,Nguyen,John T,et al.Sequential Limb Ischemia Demonstrates Remote Postconditioning Protection of Murine Skeletal Muscle[J].Plastic and Reconstructive Surgery,2009,123(25):85.

[4]Wang Q,Zhang X F,Ding Q.Limb Remote Postconditioning Alleviates Cerebral Reperfusion Injury Through Reactive Oxygen Species-Mediated Inhibition of Delta Protein Kinase C in Rats[J].Anesthesia,2011,113(5):1180.

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[8]Zhao H.The Protective Effeet of Isehemic Postconditioning Against Isehemic Injury:From the Heart to the Brain[J].J Neuroimmune Pharmaeol,2007,2(5):313.

[9]王貝娜,何龍泉,王玉.神經功能恢復作用的臨床觀察[J].中風與神經疾病雜志，2012,29(5):439.

[10]王麗華,王國輝,金玉玲,等.遠程肢體缺血后處理對急性腦梗死患者血清BDNF含量及神經功能評分影響[J] .黑龍江醫藥科學,2012,35(5):64.

[11]Xing B,Chen H,Zhang M,et al.Ischemic post-conditioning protects brain and reduces inflammation in a rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion[J].Neurochem,2008，105(5):1737.

Noninvasive limb ischemic remote postconditioning effects on acute cerebral ischemia in rats

CHANGLi-sha,ZHANGYun-he,PENGYan-bo,etal.

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospitalofNeurologyIIWardandNeurosurgery,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism on acute cerebral ischemia in rats noninvasive limb ischemic remote post.Methods54 male SD rats were randomly divided into 3 groups,18 rats in each group.Sham operation group(Sham group),ischemia reperfusion group (I/R group)and distant limb ischemic postconditioning group(RPC group).Comparison of 3 groups of rats neural function deficit score,cerebral water content,the volume of cerebral infarction,CA1 area of hippocampus cell morphological changes and cell apoptosis level.ResultsCompared with I/R group,RPC group,cerebral ischemia reperfusion injury is reduced,nerve deficit score decreased,the brain water content and reduce the volume of cerebral infarction,reduce the damage of pyramidal cells,degeneration of neurons decreased significantly,lower level of apoptosis.The difference was statistically significant.(P<0.05).ConclusionNoninvasive limb ischemic remote postconditioning has neuroprotective effects on ischemic cerebrovascular disease at acute stage.The mechanism is probably by decreasing the level of apoptosis of neural cells to achieve.

Key words:cerebral ischemia;limb ischemic postconditioning;apoptosis;noninvasive

文章編號：1007-4287(2016)05-0700-04

中圖分類號：R743.32

文獻標識碼：A

作者簡介：常莉莎(1975-)，女，博士研究生，副主任醫師，副教授，研究方向：腦血管疾病。

(收稿日期：2015-06-15)