腎移植受者多反應性抗體與HLA抗體的相關性研究

榮春書，王偉剛，連　鑫，高寶山*

(1.長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 泌尿系統疾病診治中心，吉林 長春130021)

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*通訊作者

腎移植受者多反應性抗體與HLA抗體的相關性研究

榮春書1，王偉剛2，連鑫2，高寶山2*

(1.長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 泌尿系統疾病診治中心，吉林 長春130021)

摘要：目的從單克隆抗體水平研究同種異體腎移植受者多反應性抗體與HLA抗體的相關性，探討多反應性抗體是否為HLA抗體尤其是非供體特異性抗體產生的原因之一。方法從腎移植患者外周血細胞及手術切除的移植腎組織中分離出B淋巴細胞，并于體外永生化培養獲得單克隆B細胞，分別檢測B細胞分泌的抗體對HLA抗原及凋亡細胞的反應性。結果共獲得107個B細胞克隆，檢測發現每個B細胞克隆在體外培養過程中均分泌抗體。其中有4個單克隆B細胞分泌的抗體可以與多種HLA抗原發生反應，而這些HLA抗原之間并非都有共用的抗原決定簇。進一步研究發現，這4種單克隆抗體均可以與凋亡細胞發生反應，從而表現為抗體的多反應性。結論本研究從單克隆細胞、抗體水平揭示了多反應性抗體的存在與HLA抗體的相關性，在交叉反應理論之外，為HLA抗體尤其是非供體特異性抗體的產生原因提供了實驗依據。

關鍵詞：腎臟移植；多反應性抗體；HLA抗體；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:0703)

目前，同種異體腎移植手術是治療慢性腎功能衰竭的最有效方法。器官移植致敏后產生的抗體主要為特異性抗供者HLA的抗體，即供體特異性抗體(Donor specific antibodies，DSA)，然而研究發現，腎移植受者血清中亦可檢測出非供體特異性抗體(Non-donor specific antibodies，NDSA)的出現[1-4]，在無特異性免疫致敏的前提下，NDSA產生的原因尚不完全明確。

自然抗體(Natural antibodies)是一類未經免疫致敏而廣泛存在于人類血清中的抗體[5]。自然抗體由于能夠與抗原決定簇毫不相關的多種抗原發生反應，故表現出多反應性的特點。自然抗體的重要特性是能夠與凋亡細胞結合[6-8]。長期以來，對多反應性抗體的研究主要集中于人類自身免疫性疾病領域，而針對多反應性抗體在器官移植領域的研究卻罕有報道。鑒于多反應性抗體的特性，在本研究中，我們從單克隆B細胞、抗體水平探尋多反應性抗體與HLA抗體產生的相關性。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究B淋巴細胞來源于：①一位腎移植術后一年患者的液氮中凍存的外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)；②因抗體介導排異反應而失功并被手術切除的移植腎。

1.2方法

1.2.1B淋巴細胞克隆的分離及免疫純化 將切除的移植腎在超凈臺中剪碎、研磨，并通過70 μm濾網過濾制成細胞懸液。聚蔗糖溶液中利用密度梯度法將白細胞從移植腎組織碎片中分離，利用CD19磁珠(BD公司)將CD19+的B淋巴細胞從白細胞中免疫純化。

1.2.2B淋巴細胞的體外永生化在96孔V底細胞培養板的每孔中加入50 μl由EBV轉染的狨猴B95-8細胞株培養上清液(其內含EBV)，再向每孔中加入50 μl含20% FCS的RPMI 1640，含50000個經5Gy射線照射的Jurkat細胞做為支持細胞。最后向每孔中加入CpG 2006，最終濃度為2.5 μg/ml。將稀釋后的純化B細胞懸液注入細胞培養板的各孔中，每孔30個細胞，將培養板置入37℃ 5% CO2細胞孵育箱中持續培養。直至從細胞培養孔中見到增大的細胞集落，將永生化的B細胞分別轉入細胞培養瓶中持續培養并擴增，待各淋巴細胞克隆增殖至106/ml，收集培養上清液-20℃保存待用。

1.2.3凋亡細胞制備Jurkat細胞株0.5×106/ml與200 ng/ml抗FAS抗體于37℃孵育箱內15小時。Annexin-V及7-AAD(BD公司)染色以確認細胞凋亡。

1.2.4細胞培養上清液所含抗體對凋亡細胞的反應性1×106經誘導凋亡的Jurkat細胞分別與100 μl B細胞克隆培養上清液在FACS試管中混勻，37℃孵育30 min。洗滌后向細胞混懸液的試管中分別加入抗Pan Ig-FITC，4℃避光反應30 min。洗滌后棄上清并混勻細胞。應用流式細胞儀檢測抗體對凋亡細胞的反應性，選取經染色確認的凋亡細胞群，Log2-平均熒光強度(Mean Fluorescence intensity，MFI)用以代表抗體對凋亡細胞的反應性。

1.2.5細胞培養上清液所含抗體對HLA及MICA的反應性將包被有混合MHC Ⅰ類、Ⅱ類抗原及MICA的混合微球懸液(Mixed beads)加入V型底96孔檢測板，每孔5 μl，挑選出對凋亡細胞反應陽性的B細胞培養上清液20 μl分別加入各孔，水平搖床避光混勻30 min。洗滌2次后向反應體系加入IgM-PE二抗，水平搖床避光混勻30 min。洗滌兩次后棄上清，加入80 μl PBS緩沖液充分混勻后，應用Luminex 200檢測儀檢測細胞培養上清液對HLA及MICA的反應性，MFI>1000被定義為陽性反應。選取Mixed beads檢測陽性的B細胞培養上清液，分別應用HLA Class I regular beads(主要為人工合成HLA抗原)、Class I iBEADS(主要含天然HLA抗原)及酸處理過的Class I beads(使隱蔽抗原暴露)檢測患者細胞培養上清液中所包含的HLA抗體。

2結果

2.1永生化B淋巴細胞克隆所分泌抗體對HLA抗原的反應性

本研究中，通過B淋巴細胞體外永生化，我們共獲得107個B細胞克隆，通過檢測發現每個B細胞克隆在體外培養過程中均分泌抗體。Luminex Mixed Beads檢測發現其中有4個細胞克隆(編號分別為2B4、2D9、4G4、4G10)分泌的抗體能夠與HLA I類抗原發生反應。為進一步鑒定這些抗體具體可以與哪些HLA I類抗原反應，我們分別將三種不同的HLA I類抗原微球用于下一步實驗：HLA Class I regular beads(主要為人工合成HLA抗原)、Class I iBEADS(主要為天然HLA抗原)及酸處理過的Class I beads(使隱蔽抗原暴露)，結果發現：4個不同的B淋巴細胞集落分泌的抗體可同時與多種HLA I類抗原反應。具體檢測結果見圖1。

2B4：此抗體主要與三種微球的HLA-B、HLA-C抗原反應。反應性最強的為酸處理微球B*27:05及B*27:08抗原，這兩種抗原共用抗原決定簇5011。但抗體2B4所識別的其他多種HLA抗原并不共用相同的抗原決定簇。同時，此抗體還與包被于iBEADS上的多種Cw抗原發生反應，這些Cw抗原共用抗原決定簇69R。

2D9：此抗體主要與包被于regular beads上的Regular single antigen beads(人工合成抗原)用紅色柱狀圖(中粗線)表示，iBEADS(天然抗原)用藍色柱狀圖(深色粗線)表示，酸處理過的Regular single antigen beads(隱蔽抗原)用綠色柱狀圖(細線)表示。柱狀圖高度分別代表抗體對HLA I類抗原分子的反應強度(MFI)。

圖1B細胞克隆2B4、2D9、4G4、4G10所分泌的抗體分別對HLA I類抗原分子的反應性

HLA-A及HLA-C抗原發生反應。但這些抗原并無共用的抗原決定簇。同時此抗體還與包被于iBEADS上的抗原A23、A24及A29發生反應，但這幾種抗原也無共用的抗原決定簇。此外，抗體2D9也可與包被于酸處理beads上的諸多抗原反應，而這些抗原之間也并無共用的抗原決定簇。

4G4：此抗原與包被于regular beads上的抗原C*06:02反應性最強，同時與多種HLA-B及HLA-C抗原發生反應，而這些抗原無共用的抗原決定簇。此抗原與包被于iBEADS上的抗原A69、B44、Cw2、Cw4、Cw5、Cw7、Cw12等發生反應，這些抗原之間亦無共用的抗原決定簇。同時，抗體4G4能夠與多種包被于酸處理微球上的諸多HLA-A、HLA-B及HLA-C抗原反應，而這些抗原也無共用抗原決定簇。

4G10：與2B4、2D9、4G4抗體不同，此抗體可以與包被于regular beads及酸處理beads上的大多數HLA-B及HLA-C抗原發生反應，但與包被于iBEADS上的抗原不發生反應。以上諸多抗原中并無共用抗原決定簇。

2.2永生化B淋巴細胞克隆所分泌抗體對凋亡細胞的反應性

自然抗體是一類未經免疫致敏而廣泛存在于人類血清中的抗體，自然抗體由于能夠與抗原決定簇毫不相關的多種抗原發生反應，從而表現出多反應性的特點。而自然抗體的重要特性之一是能夠與凋亡細胞結合。因此在本研究中，我們分別檢測了HLA陽性抗體2B4、2D9、4G4、4G10這4種單克隆抗體能否與凋亡細胞結合，從而揭示其多反應性。結果顯示，與陰性抗體3D4克隆對照，這四種多反應性抗體均能夠與凋亡細胞發生反應(圖2)，說明這四種HLA陽性的單克隆抗體同時也是多反應性抗體。

3討論

抗體做為一個重要因素廣泛參與實體器官移植受者對移植物的急性及慢性排異反應。在ABO血型相容的供受者匹配中，器官移植致敏后產生的抗體主要為特異性抗供者HLA抗體，然而在研究中發現，腎移植患者血清中亦可檢測出大量的非供體特異性的HLA抗體(NDSA)[1-4]，在無特異性免疫致敏的前提下，NDSA產生的原因尚不完全明確。目前普遍接受的解釋為交叉反應原理[9-12]。即由于多種HLA之間存在共用的抗原決定簇，故腎移植患者血清中產生DSA的同時也可以與供者相似的HLA抗原發生反應，從而表現為NDSA的出現。然而，有研究發現，腎移植患者在沒有產生DSA的Anti-Fas誘導Jurkat細胞后，應用Annexin V及7-AAD區分凋亡細胞與非凋亡細胞。非多反應性B細胞克隆3D4分泌的抗體做為陰性對照。

圖2多反應性B細胞克隆2B4、2D9、4G4、4G10分泌的抗體與誘導凋亡后的Jurkat細胞的反應性

情況下也可產生NDSA，腎移植術后NDSA出現的平均中位時間甚至早于DSA[9]。顯然交叉反應理論不能完全解釋這種現象。

我們通過研究發現，多反應性抗體2B4、2D9、4G4、4G10同時也能夠與多種HLA抗原發生反應。本研究從單克隆抗體水平，首次應用三種不同特征的HLA I類抗原包被的微球同時檢測克隆2B4、2D9、4G4、4G10對HLA抗原的反應性。這三類微球的特點分別為：HLA Class I regular beads主要含人工合成HLA抗原，Class I iBEADS主要為天然HLA抗原，酸處理過的Class I beads將天然構象中的隱蔽HLA抗原暴露出來。我們通過檢測發現，無論應用哪種檢測方法，這4種抗體均可以與多種HLA抗原反生反應，而絕大多數HLA抗原之間并不共用相同的抗原決定簇，由此充分說明，本研究發現的單克隆多反應性抗體，是基于它們的多反應性從而與多種HLA抗原發生反應，而并非完全由于與相同或相似的抗原決定簇發生反應從而表現為與多種HLA發生的交叉反應。因此，本研究從單克隆細胞、抗體水平揭示了多反應性抗體的存在與HLA抗體的相關性，在交叉反應理論之外，為HLA抗體尤其是非供體特異性抗體的產生原因提供了理論及實驗依據。

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The accociation between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients

RONGChun-shu1,WANGWei-gang2,LIANXin2,etal.

(1.TheAffiliatedHospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021,China;2.UrologyCenter,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the association between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients at monoclonal antibody level,to explore whether the generation of HLA antibodies could be attributed to polyreactive antibodies partially.MethodsB cell were isolated form PBMC of transplant recipients and explanted kidney allograft respectively,then monoclonal B cell clones were obtained through in vitro culture.The reactivity of antibodies secreted by B cell clones to HLA antigens and apoptotic cells was assessed.Results107 B cell clones were generated,all B cell clones have the capacity of secreting antibodies.The monoclonal antibodies secreted from four B cell clones could react to multiple HLA molecules but did not appear to target canonical “shared” epitopes.Further investigation showed that these antibodies reacted to apoptotic cells thereby revealed polyreactivity.Conclusion Our studies revealed the correlation between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients at monoclonal cells and antibodies,and provided experimental basis for the explanation of generation of non-donor specific antibodies besides the cross reactivity theory.

Key words:Kidney transplantation;Polyreactive antibodies;HLA antibodies;Apoptosis

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目81501381；吉林省自然科學基金項目20160101100JC;吉林省衛生計生青年課題項目2015Q004

文章編號：1007-4287(2016)05-0703-04

中圖分類號：R392.4

文獻標識碼：A

作者簡介：榮春書，35歲，女，碩士，主治醫師，主要研究方向：神經免疫。

(收稿日期：2016-01-15)