血清長鏈非編碼RNA CRNDE-h、GAS5檢測在預測多發性骨髓瘤預后中的價值分析

陳　林，葛付濤，沙　輝，葉　龍 ，趙　松，牛　豐*

(1.吉林大學第一醫院 脊柱外科，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 碎石中心，吉林 長春130021)

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*通訊作者

血清長鏈非編碼RNA CRNDE-h、GAS5檢測在預測多發性骨髓瘤預后中的價值分析

陳林1，葛付濤2，沙輝1，葉龍1，趙松1，牛豐1*

(1.吉林大學第一醫院 脊柱外科，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 碎石中心，吉林 長春130021)

多發性骨髓瘤(MM)是一種以局灶性骨病變、軟組織病變及彌漫性骨髓浸潤為主要特征的骨髓惡性漿細胞疾病。MM患者的主要病變為異常漿細胞的增生，而這種漿細胞產生的單克隆免疫球蛋白不具有免疫功能，從而使患者出現了免疫功能降低、骨質破壞等病理改變，進而形成了骨痛、貧血、腎功能不全、感染、多系統多器官損害等復雜的臨床表現[1]。雖然中老年人群是MM的多發人群，但近年來其發病年齡呈現出了年輕化的趨勢，而且由于MM缺乏特異性的首發癥狀，因而極易導致誤診或漏診，進而對患者的治療效果和預后產生影響。化療是臨床上治療MM的主要方法，但化療對于難治性、復發性MM患者的療效欠佳，患者的生存期卻未見顯著的延長[2]。因此，臨床上近年來先后研發了來那度胺、硼替佐米、卡非佐米等新型藥物和序貫自體造血干細胞移植(AHSCT)、異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)等新型治療方法，相關研究結果顯示，這些新型療法在提高MM患者的緩解率和生存質量等方面均具有一定的價值[3]，而且MM患者對藥物反應的個體差異較大，這使患者的預后也存在著較大的差異，對于MM患者的預后做出及時、準確的評價對于制訂合理的治療方案具有積極的意義。隨著醫學科技的不斷進步，針對MM的診斷、病情評價和預后預測研究已不再局限于骨髓活檢與影像學檢查，而是向血清游離輕鏈、細胞遺傳學和分子生物學檢測等方向發展[4]。近年來的研究發現，長鏈非編碼RNA(lncRNA)能夠對正常細胞與腫瘤細胞的基因表達發揮重要的調控作用，可通過類似癌基因或抑癌基因的作用，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等調控過程，因此，研究者開始嘗試將lncRNA作為一種標志物用于惡性腫瘤的預后預測[5]，本研究針對血清lncRNA CRNDE-h、GAS5檢測在預測MM預后中的價值進行了觀察和分析，現將研究的具體情況報告如下。

1材料與方法

1.1一般資料

選取2009年12月至2010年12月我院收治的80例MM患者作為病例組，納入的患者均符合國際多發性骨髓瘤工作組(IMWG)2003/世界衛生組織(WHO)2008中的MM 診斷標準，患者的預計生存期均超過3個月，排除合并有其他種類惡性腫瘤、精神疾患及重要器官器質性病變的患者。在納入的患者中，男性患者為42例，女性患者為38例，年齡為35至73歲，平均為(56.3±8.1)歲。選取同期在我院接受體檢的健康人80例作為對照組，均經臨床檢查排除MM及其他惡性腫瘤，其中，男性為45例，女性為35例，年齡為37至76歲，平均為(57.6±8.7)歲。兩組研究對象的年齡、性別構成等方面的差異均無統計學意義(P>0.05)。研究對象均簽署知情同意書，研究方案經我院醫學倫理委員會審核通過。

1.2治療方法

對納入的所有MM患者均行4個療程PAD方案誘導治療，具體方案為硼替佐米1.75mg d1，d4，d8，d11+表柔比星20 mg d1-4+地塞米松 20 mg d1-4，d8-11，以28 d為1個療程。

1.3觀察指標和檢測方法

采集兩組研究對象(病例組患者于接受治療前)的清晨空腹外周血標本，提取血清后置于-80℃冰箱中保存待測，應用 miRNeasy Serum/Plasma Kit 提取血清總RNA，采用實時熒光定量PCR法(q-RT PCR法)定量檢測血清標本中的lncRNA CRNDE-h、GAS5水平，以cel-miR-39為內參，引物序列見表1，反應體系見表2，共反應45個循環，讀取目的lncRNA及內參的循環閾值(Ct值)，△Ct為目的lncRNA的Ct 值與cel-miR-39的Ct 值的差值，以2-△△Ct表示目的lncRNA的表達水平；根據IMWG制定的療效評價標準，對病例組患者治療2個療程、4個療程時的療效進行評價和比較，主要分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)、疾病進展(PD)4個等級，以療效為CR或PR為臨床有效；對患者進行為期4年的隨訪，隨訪方式為電話隨訪及登門隨訪相結合，對患者的總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)進行觀察和比較。

表1　目的lncRNA引物序列

表2　q-RT PCR反應體系

1.4統計學方法

本研究所有數據均應用SPSS 13.0統計軟件包建立數據庫，計量資料比較應用獨立樣本t檢驗進行處理，計數資料應用卡方檢驗進行處理，不同血清lncRNA水平患者的OS、PFS的比較應用Kaplan-Meier生存分析法進行處理，LogRank檢驗生存期的差異，應用Cox回歸進行影響生存期的多因素分析，以上統計學檢驗均以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組研究對象血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達量的比較

病例組患者的血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達量均高于對照組，兩組之間的差異均有統計學意義，見表3。

表3　　　兩組研究對象血清lncRNA CRNDE-h、

2.2不同血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達量MM患者的臨床療效的比較

以病例組患者的血清lncRNA CRNDE-h相對表達量均數為界值，將病例組分為CRNDE-h低表達(40例)和CRNDE-h高表達(40例)兩個亞組，以病例組患者的血清lncRNA GAS5相對表達量均數為界值，將病例組分為GAS5低表達(40例)和GAS5高表達(40例)兩個亞組，不同血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達量的MM患者的療效和臨床有效率的差異均無統計學意義，見表4-7。

表4　不同血清lncRNA CRNDE-h相對表達量MM患者治療2療程時療效的比較(例，%)

表5　不同血清lncRNA CRNDE-h相對表達量MM患者治療4療程時療效的比較(例，%)

表6　不同血清lncRNA GAS5相對表達量MM患者治療2療程時療效的比較(例，%)

表7　不同血清lncRNA GAS5相對表達量MM患者治療4療程時療效的比較(例，%)

2.3不同血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達量MM患者的預后情況的比較

對本組患者的隨訪期截止于2014年12月31日，Kaplan-Meier生存分析結果顯示，本組MM患者的OS估計值為31.164個月，95%CI 為(27.089-35.239)個月，PFS估計值為24.835個月，95%CI 為(21.422-28.249)個月。CRNDE-h低表達和CRNDE-h高表達患者的OS估計值為37.125個月和22.575個月，95%CI 為(31.955-42.295)個月和(18.589-26.561)個月，PFS估計值為29.538個月和18.237個月，95%CI 為(25.213-33.864)個月和(14.224-22.250)個月，兩亞組患者的OS和PFS的差異均有統計學意義(χ2=7.876、7.009，P<0.05)。GAS5低表達和GAS5高表達患者的OS估計值為34.030個月和23.546個月，95%CI 為(28.717-39.343)個月和(19.270-27.823)個月，PFS估計值為26.794個月和19.753個月，95%CI 為(22.255-31.333)個月和(15.897-23.609)個月，兩亞組患者的OS和PFS的差異均無統計學意義(χ2=2.390、1.444，P>0.05)。Cox多元回歸分析結果顯示，本組患者的OS與血小板減少、乳酸脫氫酶增高、P53缺失、CRNDE-h高表達均具有相關性(P<0.05)，PFS與P53缺失、CRNDE-h高表達均具有相關性(P<0.05)，見表8、9。

表8　本組患者總生存期(OS)的Cox多因素分析

表9　本組患者無進展生存期(PFS)的Cox多因素

3討論

目前，在人類基因中已經確定的lncRNA約有10000種[6,7]。相關研究已發現，某些lncRNA在惡性腫瘤組織及患者血清中呈現特異性高表達，參與了腫瘤細胞的增殖-、凋亡、侵襲、轉移過程，與腫瘤的發病、復發、轉移和耐藥等臨床治療關鍵因素密切相關[8,9]，目前的研究已證實，lncRNA在惡性腫瘤病理過程中的作用機制主要包括影響WIF1、PTEN、p21等基因表達、調控Wnt、Akt及p53等信號通路、提升E-cadherin和CDH13表達、降低Vimentin、MMP2和MMP9表達及影響細胞周期等[10,11]，因此，lncRNA也被作為特異性標志物用于惡性腫瘤的診斷、靶向治療、療效評價和預后預測的研究之中。

CRNDE是ColoRectal Neoplasia Differentially Expressed(結腸直腸瘤形成差異表達)的基因符號，可轉錄為一種多功能lncRNA，在人類和小鼠大腦的特定區域中表達，在小鼠直系同源在誘導多能干細胞中呈現高表達，并在神經分化中進一步增加。CRNDE具有polycomb抑制復合體2(PRC2)、CoREST染色質修飾復合體等不同剪接形式，這為調控復合體提供了特定的功能支架，并形成了非常組織特異性的表達模式。lncRNA CRNDE與癌癥、神經生物學和發育等生物學行為具有密切關系，它最初被鑒定為一種在結腸直腸癌中表達非常高的lncRNA，但隨著研究的不斷擴展，相關研究證實，這種lncRNA的表達量也在神經膠質瘤等許多其他實體瘤和白血病中是上調[12]。CRNDE復雜的選擇性剪接導致了來自該基因具有眾多的轉錄本，而在針對癌細胞的體外試驗中，研究者發現在抑制了GVC-IN4等CRNDE的核轉錄本后，可抑制PI3K/Akt/mTOR通路或Raf/MAPK通路兩個信號通路級聯的下游靶標，進而影響許多與胰島素/IGF等相關基因的表達[13]。GAS5是Growth Arrest-specific transcript 5(生長停滯特異性轉錄本5)的基因符號，其內含子內編碼了多個ncRNA，而其外顯子序列則轉錄出lncRNA[14]，lncRNA GAS5可對糖皮質激素及其受體發揮抑制作用，能夠負調控淋巴和乳腺細胞的存活[15]。目前的研究已證實，lncRNA GAS5與多種惡性腫瘤的發病和進展具有相關性，例如，lncRNA GAS5能夠使有效調控前列腺癌細胞的促凋亡活性，GAS5異常的低水平表達能夠降低前列腺細胞對化療試劑的反應性[16]。相關研究已顯示，lncRNA GAS5與腎細胞癌、非小細胞肺癌(NSCLC)等惡性腫瘤的預后具有相關性[17]，因此，也成為近年來研究較多的與惡性腫瘤預后相關的新型分子標記物。本研究結果顯示，病例組患者的血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達量均高于對照組，不同血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達量的MM患者的療效和臨床有效率的差異均無統計學意義，這說明MM患者可表現為血清lncRNA CRNDE-h、GAS5的高表達，這兩個指標可提示MM的發病風險，可作為MM診斷的血清標志物，但其水平與MM的治療效果缺乏相關性，不能用來評價治療的臨床療效；血清lncRNA CRNDE-h低表達患者的OS和PFS顯著長于血清lncRNA CRNDE-h高表達患者，而不同血清lncRNA GAS5表達水平的患者的OS和PFS的差異均無統計學意義，患者的OS與血小板減少、乳酸脫氫酶增高、P53缺失、CRNDE-h高表達均具有相關性，PFS與P53缺失、CRNDE-h高表達均具有相關性，說明血清lncRNA CRNDE-h的高表達與MM患者的不良預后具有相關性，血清lncRNA CRNDE-h表達水平可作為預測MM患者預后的輔助指標。

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文章編號：1007-4287(2016)05-0796-04

(收稿日期：2015-02-14)