檸檬酸調節水體酸堿度抑制黃絲藻藻華的研究

王愛卿，楊仕豪，李西雨，潘連德

(上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上?！?01306)

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檸檬酸調節水體酸堿度抑制黃絲藻藻華的研究

王愛卿，楊仕豪，李西雨，潘連德

(上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海201306)

摘要：用檸檬酸調節試驗水體pH值，并保持在5.0、5.5、6.0和6.5四個梯度下，將采自養殖池塘的黃絲藻(Tribonema sp.)藻華的10 g藻絲體放入試驗水體，每隔48 h采樣一次，觀察黃絲藻藻絲體外部形態、顯微結構的變化。同時測定其葉綠素a(Chl a)、丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性。結果表明：96 h黃絲藻藻絲體大量下沉，有些藻絲體斷裂，無氣泡產生，水體開始混濁；192 h水體混濁、藻絲體斷裂并溶解的現象進一步明顯；192 h各試驗組藻細胞內葉綠體集于中央，并呈現不同程度的解體，細胞結構也變得模糊，細胞質膜與細胞壁之間的空隙增大。四個試驗組Chl a含量明顯低于對照組。對于SOD、CAT的活性，pH5.0的試驗組呈現下降趨勢，而pH 5.5、6.0、6.5的試驗組呈現先增長后下降的趨勢；各個試驗組MDA明顯高于對照組，這說明192 h后黃絲藻藻絲體受到嚴重的破壞，開始解體、死亡。試驗得出結論：用檸檬酸降低水體pH值，可以有效抑制或殺死了黃絲藻，從而控制了黃絲藻藻華。

關鍵詞：檸檬酸；黃絲藻(Tribonema sp)；葉綠素a；抗氧化酶

在養殖水體，絲狀藻類旺盛生長形成藻華(俗稱青苔)，消耗水體中無機鹽，釋放有毒物質，使水質變得清瘦，毒害水生生物[1]。蝦、蟹頰部、額部、基關節附著絲狀藻類，會使蝦、蟹活動困難，進食減少，嚴重時致其窒息死亡[2]。在景觀水體，藻類大量爆發時既影響水體的景觀效果，也使水體散發異味，對周圍環境造成影響[3]。

目前，常用控制藻類的方法主要有物理法[4]、化學法[5-7]和生物法[8-10]。盡管上述方法在短期內都能有效控制水體藻類，但長期使用會對生態系統產生壓迫，并且經濟成本高[11-12]。因此，需要尋找一種既能有效控制藻類，又對環境的破壞性小，便于長期操作的辦法。

表層水體的pH是一個重要的環境因素，它能在很大程度上影響藻類種群的增長[13]。在排除其它外界環境因素的條件下，藻類只有在一定的pH值范圍內才能生長良好，如果超出這個范圍，藻類活性就會受到抑制或死亡[14]。藻類喜歡生長于偏堿性水體(pH7.7～9.4)，因此在一定的范圍內，可以把養殖水體pH值調到偏酸性，進而可以抑制藻類生長[15]。Axelsson等[16]發現在酸性條件下，高濃度的金屬和低濃度的營養鹽對藻類的生長有間接抑制效果，而氫離子的濃度對藻類有直接的破壞作用。

目前，針對絲狀藻類的研究主要是其作為初級生產者對周圍環境的影響[17-20]，而作為有害藻華的相關研究較少[5,21]。本研究利用檸檬酸改變水體pH值來進行黃絲藻(Tribonemasp)藻華的抑制試驗，探索養殖水體黃絲藻等絲狀藻藻華的預防與控制的新思路和新方法。

1試驗材料

檸檬酸購自國藥集團化學試劑有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

黃絲藻藻華采集于上海浦東新區臨港新城一個養殖池塘，去除其上所附的雜草、螺類，放入超白玻璃缸內，注入河水，室內自然光照下暫養、備用。

2試驗方法

2.1檸檬酸添加頻率的確定

分別配置pH值5.0、5.5、6.0、6.5四個不同梯度的檸檬酸溶液，并設對照，每組設3個重復。連續進行pH值測定，以便于觀察水體pH值的變化趨勢，確定檸檬酸添加頻率。

表1　不同處理組12 h 后的pH值變化

注：偏離量平均值中數據為平均值±標準差，后綴相同字母之間表示沒有顯著差異(P>0.05),不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，下同。

由表1可知，12 h各試驗組pH值與設定值出現一定的偏差，就平均值而言，pH值5.5時，偏離程度最小，pH值為5.0時，偏離程度最大。對每一次的偏離量的絕對值進行平均后發現，4個處理之間pH值偏離值沒有明顯差異。所以，確定間隔12 h為檸檬酸的最佳添加時間。

2.2黃絲藻藻絲體培養方法和條件

分別稱取10 g的黃絲藻藻絲體，蒸餾水洗凈，放于3 L含有BG11培養基的對照組(pH=7.8)與加有檸檬酸調節pH值為5.0、5.5、6.0、6.5四個不同梯度的BG11培養基中，日光燈照射，光照度為 2 000 lx，光暗比為 12 h∶12 h，溫度22 ℃，充氣培養。

2.3pH對黃絲藻藻絲體結構的改變

肉眼觀察不同pH值條件下黃絲藻藻絲體顏色、沉降、光合作用產生的氣泡，水體混濁現象及藻絲體的斷裂與自溶等表觀特征。

使用顯微鏡(型號：BH-2，×20倍、×40倍)分別觀察不同pH值條件下黃絲藻細胞壁、細胞膜、色素體的變化。

2.4pH對黃絲藻藻絲體Chla含量的影響

每隔48 h取一次樣，測定Chla含量，連續進行192 h。取0.12 g黃絲藻藻絲體，用吸水紙吸干，放入具塞刻度試管，迅速轉移至冰箱冷凍室冷凍12 h和以上或過夜，取出后立即加入15 mL已經預熱(80 ℃)的95%乙醇中，并在恒溫水浴鍋中80 ℃萃取2 min，緊接著使用超聲波細胞粉碎儀(冰浴中)進行粉碎，放入4 ℃冰箱黑暗靜置4 h后，轉入有刻度的離心管中，定容至15 mL，離心10 min(4000 r/min)，取上清液于分光光度計上測定663 nm、645 nm和630 nm下的吸光度值[22]。Chl a含量按照下列公式計算：

Ca=[11.64(OD663)-2.16(OD645)+0.10(OD630)]×V/M

式中：Ca為1 g藻絲體中所含的Chl a量(mg/g)；V為定容的體積(L)；M為稱取的藻絲體的重量(g)。

2.5pH對黃絲藻藻絲體兩種抗氧化酶活性及MDA含量的影響

每隔48 h取一次樣，測定黃絲藻藻絲體兩種抗氧化酶活性及MDA含量，連續進行192 h。參考Furey等[23]方法，取0.20 g的黃絲藻藻絲體，吸干、剪碎，加入冷卻至4 ℃的0.05 mol/L磷酸緩沖液5 mL(pH=7.82，內含4 mmol/L EDTA-Na2)，在冰水浴中用超聲波細胞粉碎儀破碎，勻漿液8000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集上清液，用于測定SOD、CAT、MDA，樣品處理完后24 h內測定完畢。

2.6數據分析

試驗數據用SPSS13.0單因素方差分析(One-way ANOVY)進行Duncan′s法多重比較，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

3結果

3.1pH對黃絲藻藻絲體結構的改變

3.1.1pH對黃絲藻藻絲體外部形態的改變

從圖1、圖2可以看出，試驗組藻類由于受到不同程度的損害，96 h和192 h試驗組與對照組出現了明顯的差異性。192 h與96 h相比，pH 6.5的試驗組，水體混濁度明顯增加，無氣泡產生，藻類顏色變為黃褐色，藻絲體斷裂，沉于瓶底。pH 6.0的試驗組混濁度增加，數量明顯減少。pH 5.5和5.0的水體，幾乎看不到藻絲體，說明基本已經溶解。

圖1　96 h不同pH值條件下黃絲藻藻絲體外部形態結果

圖2　192 h不同pH值條件下黃絲藻藻絲體外部形態結果

3.1.2pH對黃絲藻藻絲體顯微結構的改變

從圖3、圖4中可以看出，192 h四個試驗組與對照組出現了明顯差異，pH5.0的試驗組中毒現象最為嚴重，黃絲藻藻絲體接近死亡，與對照組相比，試驗組的色素體集中于細胞中央，含量明顯減少，顏色呈黃灰色，細胞結構也變得模糊，細胞質膜與細胞壁之間的空隙增大。隨著pH值升高，則中毒現象減輕。pH值5.5、6.0、6.5的試驗組藻類色素體含量高于pH值5.0的試驗組，黃綠色藻類較多，這說明處理192 h各個試驗組葉綠體受到破壞，葉綠素的合成受到阻礙。

3.2pH對黃絲藻藻絲體Chla含量影響

由表2，圖5可知，在加入檸檬酸48 h，對照組pH值8.2，黃絲藻藻絲體Chla含量為0.972 mg/g，而pH值5.0、5.5、6.0、6.5實驗組含量分別為0.558、0.605、0.707、0.822 mg/g，試驗組與對照組表現明顯的差異性。pH值5.5、6.0、6.5的試驗組含量呈現先增長后下降的趨勢，而pH值5.0的試驗組一直保持下降趨勢。說明pH值5.0的較酸性環境，使黃絲藻細胞受到破壞，所以沒有進行增殖便開始死亡。而其它試驗組由于受到酸性環境的有效刺激，促進其增長，但是隨著時間的延長，則出現了抑制現象。

3.3pH對黃絲藻藻絲體兩種抗氧化酶活性、MDA含量的影響

3.3.1pH對黃絲藻藻絲體SOD活性的影響

由表3，圖6可以看出，pH值5.5、6.0、6.5的環境條件下，SOD呈現先增長后下降的增長趨勢，而pH值5.0的試驗組表現為下降趨勢，但總體上都低于對照組。

圖3　192 h后黃絲藻藻絲體顯微結構中毒結果(×20)

pHChla含量/(mg/g)48h96h144h192h對照0.972±0.092a1.226±0.075a1.465±0.136a1.537±0.112a5.00.558±0.011d0.445±0.049c0.410±0.012d0.237±0.052e5.50.605±0.058cd0.833±0.082b0.644±0.018c0.464±0.021d6.00.707±0.08bc0.975±0.058b0.926±0.041b0.614±0.082c6.50.822±0.046b1.156±0.123a1.319±0.133a0.878±0.109b

圖4　192 h后黃絲藻顯微結構中毒結果(×40)

pHSOD活性/(U/mgprot)48h96h144h192h對照55.369±0.798c69.154±0.700a71.195±1.429a70.747±1.811a5.036.365±0.765e32.576±2.111c26.893±1.634c10.809±1.864e5.546.254±1.484d51.453±2.184b48.972±1.549b29.037±1.351d6.062.934±1.189b66.685±1.097a71.413±1.820a37.857±2.192c6.568.393±2.600a68.713±1.435a70.304±1.130a65.369±2.989b

圖5　不同pH值對黃絲藻藻絲體葉綠素a含量的影響

圖6　不同pH值對黃絲藻藻絲體SOD活性的影響

3.3.2檸檬酸對黃絲藻藻絲體CAT活性的影響

由表4，圖7可知，試驗組與對照組出現明顯差異性，pH值5.5、6.0、6.5的試驗組呈現先增長后下降的趨勢，而pH值5.0的試驗組保持下降趨勢，并且都明顯低于對照組。

表4　不同pH值對黃絲藻藻絲體CAT活性的Duncan′s比較

3.3.3pH對黃絲藻藻絲體MDA含量的影響

由表5，圖8可知，試驗組MDA含量明顯高于對照組，192 h各個試驗組呈先增長后下降的趨勢，并且酸性越強，MDA含量越高。說明試驗組黃絲藻藻絲體由于受到酸性環境的脅迫，細胞遭到破壞程度最嚴重。

表5　不同pH值對黃絲藻藻絲體MDA含量的Duncan′s比較

注：表中MDA單位：nmol/mgprot

4討論

根據黃絲藻藻絲體結構的變化，葉綠素a含量和各種抗氧化酶指標的測定結果發現，192 h各個試驗組與對照組相比，表現出明顯的抑制效果。并且抑制率與酸度成正比關系。抑制率從高到低的順序依次為：pH 5.0>pH 5.5>pH 6.0>pH 6.5>對照組。針對調節pH值來控制絲狀藻的相關研究仍較少，但是Wang等[15]的研究表明：使用CO2調節試驗水體pH值在5.5和6.0時，可以直接殺死銅綠微囊藻，而在pH值6.5的水體，銅綠微囊藻的生長受到抑制，但不會出現死亡。李靜會等[24]

圖7　不同pH值對黃絲藻藻絲體CAT活性的影響

圖8　不同pH值對黃絲藻藻絲體MDA含量的影響

使用醋酸治理玄武湖藍藻藻華實驗結果表明：當平均用量為26.87 g/m3，水體表面pH值為5.5時，實驗區藻類總量下降了82.8%。這與本試驗研究有相似之處，說明一定的酸性條件可以抑制或殺死藻類。但對于不同的藻類，其抑制效果可能會有差異。對于其作用機理有兩種推測，其一：過量的H+降低碳酸酐酶活性，從而使CO2濃縮機制受到影響，進而導致藻類死亡[25]；其二：過量的H+對藻細胞的內部結構有直接的破壞作用，從而使光合作用受到影響；特別是降低細胞質和葉綠體內pH值，從而阻止卡爾文循環，因此降低了開放式光合系統II反應位點數量[26]。

Chla在光合作用的光能收集、傳遞和轉化中起不可替代的作用，其含量的高低直接影響植物對于光合能量的利用，進而影響到光合能量的凈積累，最終會以產量和生物量的形式表現出來[27]。本研究中四個試驗組的Chla含量明顯低于對照組，這可能是由于酸性條件抑制了黃絲藻藻華Chla的合成或造成了Chla的分解。有研究表明：pH值5.5、6.0、6.5的環境條件下，銅綠微囊藻和魚腥藻的Chla含量明顯下降[16]。這與本試驗的結果相似。

藻類光合作用過程包括光化學過程和酶促過程。藻類光合磷酸化過程的速度受酶控制，而酶在水溶液環境中的解離狀態和行為，都受到氫離子濃度的影響。氫離子濃度對酶促反應的速度不僅有明顯的影響，而且影響機理也不同[28]。對于酸性條件下，藻類各種抗氧化酶活性的變化目前還沒有研究。本試驗的研究結果顯示除pH值5.0的試驗組藻絲體SOD、CAT活性隨時間呈下降趨勢外，其它試驗組均表現為先增長后下降的趨勢，表明了當過度的酸性環境刺激，會造成抗氧化酶系統的失活，而適度的酸性環境脅迫會增強抗氧化酶活性，從而加強了清除活性氧的綜合能力。但是隨著處理時間的延長和脅迫程度的加重，各種抗氧化酶協同清除活性氧的綜合能力下降，就會積累更多的活性氧，產生嚴重的氧化脅迫，進而影響細胞活性。

結合試驗結果和分析表明，在使用檸檬酸調節水體pH值在5.0～6.5之間，對黃絲藻藻絲體都有一定的抑制效果。因此，在黃絲藻等絲狀藻藻華爆發的養殖水體，可以通過人為方法適當改變水體pH值以達到抑制絲狀藻藻華的目的。

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(責任編輯：陳細華)

Growth inhibition of Tribonema bloom by acidification using citric acid

WANG Ai-qing， YANG Shi-hao，LI Xi-yu，PAN Lian-de

(KeyLaboratoryofExplorationandUtilizationofAquaticGeneticResourcesofChinaMinistry

ofEducation,ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306,China)

Abstract：The Tribonema filaments,weighing 10g,taken from aquacultural ponds were added to four different acidic experimental water (constant pH 5.0,5.5,6.0,and 6.5) driven by citric acid.The external morphology and microscopic structures of Tribonema filaments were observed every 48 h.Meanwhile,the contents of chlorophyll a (Chl a) and malondialdehyde (MDA),and the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were measured.The results showed that after 96 h exposure,lots of Tribonema filaments sank and a fraction of them broke;cloudy water began to appear but free of bubbles.After 192 h exposure,the phenomenon of cloudy-water,and fracture and dissolving of algal filaments became further conspicuous.The intracellular chloroplasts of each test group gathered in the center of cells and showed different levels of disintegration;cell structure became fuzzy;the gap between cell membrane and cell wall increased.The contents of Chl a of each experimental group were significantly lower than that of the control.The group of pH 5.0 showed a tendency to decrease the activities of SOD and CAT,while the other groups increased at first and then decreased on that.MDA contents of each experimental group were significantly higher than that of the control,indicating that Tribonema filaments were severely damaged and began to disintegrate and die after 192 h exposure.It was concluded that acidic water driven by citric acid could effectively inhibit or kill Tribonema sp.and thus control Tribonema blooms.

Key words：citric acid;Tribonema;chlorophyll a;antioxidant enzymes

收稿日期：2014-05-09；

修訂日期：2016-01-13

第一作者簡介：王愛卿(1986-)，女，碩士研究生， 研究方向：絲狀藻環境控制生態學，E-mail：13825276702@163.com通訊作者：潘連德。E-mail：ldpan@shou.edu.cn

中圖分類號：S946.3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)03-0052-08

資助項目：上海市高校知識服務平臺項目(ZF1206)；上海海洋大學研究生科研基金項目