豚鼠耳蝸基底膜振動的測試方法

周　雷　許立富　塔　娜　饒柱石　黃新生△

(1復旦大學附屬中山醫院耳鼻咽喉科　上海　200032;2上海交通大學振動、沖擊、噪聲研究所機械系統與振動國家重點試驗室　上海　200240)

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豚鼠耳蝸基底膜振動的測試方法

周雷1許立富2塔娜2饒柱石2黃新生1△

(1復旦大學附屬中山醫院耳鼻咽喉科上海200032;2上海交通大學振動、沖擊、噪聲研究所機械系統與振動國家重點試驗室上海200240)

【摘要】目的探索豚鼠耳蝸基底膜振動測試的方法。方法用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉豚鼠后,腹側切口,逐層切開皮膚,分離肌肉,可見聽泡位于豚鼠下頜骨內側深面,鈍性分離聽泡表面的肌肉組織,暴露聽泡,用電鉆將聽泡打開,可見螺旋形耳蝸結構,辨認基底膜所在的部位。用電鉆在需要開孔的骨壁上輕磨一個環形的凹陷,待足夠薄弱的時候用尖頭的刀片挑開骨片。用具有微細尖端的不銹鋼針蘸取少量反光微珠,放置在基底膜上。然后用激光多普勒測振儀(laser doppler vibrometer,LDV)測量基底膜在外耳道純音激勵下的振動。結果用該方法測量了豚鼠耳蝸基底膜在不同頻率聲波激勵下的響應曲線。結論該方法可進行豚鼠耳蝸基底膜振動的離體實驗,但活體的振動測試尚需進一步的探索。

【關鍵詞】耳蝸;基底膜;激光多普勒測振儀;豚鼠;振動

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (8117091,11072145).

聽覺是非常重要的感覺,對聽覺機制的研究從未停止。19世紀60年代,Békésy在大量試驗和觀測的基礎上提出了基底膜的行波理論,即不同頻率的純音輸入可以在基底膜的不同部位產生最大的振幅。靠近卵圓窗處的基底膜對高頻聲音敏感,而蝸孔處的基底膜對低頻聲音敏感。然而,由于螺旋器的存在,使得基底膜具有更加復雜的主動機制參與聲波信號的調制。1978年,Kemp[1]發現的耳聲發射便是耳蝸基底膜主動特性的一個反應,作為客觀測聽在臨床上已經廣泛使用。

目前,人們對基底膜主動特性的了解還不夠深入,對基底膜主動特性的探索具有重要意義[2]。哺乳動物具有相似的外、中、內耳結構,其中豚鼠的中、內耳結構與人極為相似,具有十分敏銳的聽力,且個體小、易飼養,常被選做耳科實驗動物[3]。除以上的優勢外,豚鼠的耳蝸直接暴露在聽泡中,耳蝸壁薄,有利于實驗的進行[4]。因此,本實驗選用豚鼠作為實驗對象。

國外關于豚鼠耳蝸實驗有較多的文獻報導,主要研究耳蝸毛細胞的主動機制以及聽覺神經傳導通路[5-7]。國內郭夢和等[8-10]研究了各種理化因素對基底膜響應的影響。近年Chen等[11]用豚鼠進行了圓窗激勵振子的實驗研究,并用激光多普勒測振儀測量基底膜的振動來評價激勵的效果。以上實驗方法有相似之處,但均缺少對具體實驗細節的描述,使得實驗難以重復。本研究初期借鑒了這些實驗方法,但是未能達到預期測試效果。本文試圖尋找合適的麻醉狀態下豚鼠耳蝸開孔及基底膜振動測試的方法。

材 料 和 方 法

動物和儀器選用英國種純色豚鼠28只,雌雄不拘。動物的使用通過了復旦大學附屬中山醫院倫理審查委員會的倫理審查。實驗器材包括:解剖顯微鏡 (Leica m651)、耳科電鉆 (瑞士彼岸)、耳科顯微解剖器械、小動物解剖臺、電熱毯、反光微珠 (Polytec Glass Beads)、激光多普勒測振儀(Polytec OFU 500)、信號發生器 (Tektronix AFG 3022B)、數據采集系統。麻醉藥物包括新鮮配制的1.5%戊巴比妥鈉和地西泮。

麻醉與氣管切開本實驗選用的28只豚鼠中,14只用于麻醉后行活體實驗探索,體質量為 (582.32±138.24)g,另外14只豚鼠進行離體實驗。在進行實驗之前,豚鼠均通過健康檢查,無中耳病變。

因豚鼠對麻醉比較敏感,麻醉死亡率高。本實驗解剖及測試時間均較長,需要盡量延長豚鼠的麻醉維持時間,所以選擇合適的麻醉方式十分關鍵。麻醉藥物為新鮮配置的1.5%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射,地西泮5 mg/kg肌肉注射。術中根據需要補充初始麻醉劑量的1/3。平均麻醉維持時間為 (3.14±1.67)h。由于豚鼠麻醉后容易出現呼吸困難,因而術中需要進行氣管切開并置管。因未使用肌松劑,不需要進行輔助呼吸。

離體實驗的14只豚鼠采用過量戊巴比妥鈉腹腔注射進行過量麻醉,然后予以斷頭,將聽泡解剖出后進行開孔及測試。

體位及解剖活體實驗時豚鼠的體位對實驗順利進行有重要的影響。如能維持穩定的體位,將有利于實驗的進行。本文采用顳骨夾將豚鼠固定于仰臥垂頭位。

待麻醉起效后,剪去豚鼠手術側下頜至頸部周圍的毛發,并清除散落的毛屑。然后將豚鼠固定在小動物解剖臺上,縱向切開豚鼠一側下頜頸部的皮膚,長約3 cm (如圖1所示的切口部位)。分離肌肉層,避開肌肉層下方的血管,避免不必要的出血。用顯微撐開器將肌肉組織和下頜骨撐開,盡可能拓寬手術視野(圖2)。分離并刮開聽泡上的肌肉后便可看到白色、蛋殼樣、呈球面的聽泡[4]。向兩邊分開或去除聽泡上的肌肉組織,以利于后續實驗的進行。

耳蝸壁開孔豚鼠耳蝸骨壁堅硬而質脆,外力下容易破碎,所以不易打開一個合適大小的孔。實驗初期曾采用國外文獻中描述的方法,即用小的尖刀片緩慢將耳蝸壁削薄,然后再開孔[6,12-13]。但實際中操作十分困難,不適當的外力下容易使耳蝸破碎,改進實驗方法以后便沒有破碎發生。

RW:Round window;BM:Basilar membrane.

圖1豚鼠體位示意圖及打開聽泡后的視野

Fig 1Illustration of guinea pig position and incision view after opening of the bulla

1:Basilar membrane; 2:Osseous spiral lamina; 3:Tympanic membrane; 4:Incus; 5:Incudostapedial joint;6:The basal turn of the cochlea.The right figure was the amplified view of the opening route on the cochlea.

圖2顯微鏡下的豚鼠鼓室內結構

Fig 2Structures of tympanic cavity of guinea pig under microscope

經過多次摸索之后我們選用耳科電鉆來開孔[7]。選用直徑0.6 mm的金剛鉆,低速模式 (轉速低于7 000 /s),盡可能減少鉆頭振動對內耳的影響[14]。先用電鉆在需要開孔的部位劃出一個環形的區域 (圖3),直徑比開孔的孔徑稍大,緩慢加深這條溝,直至溝的顏色變深,提示骨壁已經很薄。然后用刀刃長度5 mm、寬度1 mm的針式刀片的尖端輕輕插入這個環形磨薄區域的任一薄弱部分,稍用力挑起便可將骨片挑開,即完成開孔。如果刀片此時不能輕輕刺破這層已經被打薄的骨壁,則需要繼續打磨,直至可以被刀片尖端輕易刺破。

放置反光微珠為減輕負重對基底膜的影響,測試所用的反光微珠為直徑10～30 μm的玻璃球,肉眼下呈粉末狀。用鈍頭的不銹鋼針 (長度5 cm,針的末端直徑0.12 mm)蘸取適量干燥的反光珠。微珠將被吸附在針的末端,但常會吸附過多的微珠。此時可在顯微鏡下將過多的微珠手動去除掉。然后將微珠小心放入耳蝸基底膜上。因為液體表面張力的作用,微珠很難被放入基底膜上,有時需要多次的嘗試。此時顯微鏡的空間分辨率尤為重要,高分辨率的顯微鏡可以幫助辨識微珠及基底膜的位置(圖4)。放置過程中會有少量淋巴液損失,活體標本會自行充盈,而離體標本則需要用生理鹽水進行補充。

The left figure illustrated the bulla of guinea pig after opening of the cochlea boney wall.The right figure displayed theprofile of the cochlea by cutting along the line AB.ST: Scala tympani; SV:Scala vestibuli;CD: Cochlear duct;BM:Basilar membrane;VM:Vestibular membrane.

圖3豚鼠耳蝸骨壁開孔示意圖

Fig 3Diagram of the drilling process on the cochlea boney wall of guinea pig

基底膜振動測試如圖5所示,本文采用信號發生器發生單頻信號,驅動美國Etymotic公司的ER-2送聲器,送聲探管放置在外耳道中,外耳道口由送聲管末端自帶的海綿體封閉。ER-2送聲器的頻率范圍是10～10 000 Hz,根據Ren等[13]的改造方法,可以將其頻率范圍提高到20 kHz,從而滿足了本實驗的要求。同時將測聲系統ER-7C的測聲探管放置在外耳道中距鼓膜2～3 mm處,用于監測離鼓膜臍部2 mm處的聲壓。將激光探頭 (Polytec OFV 505)連接到單點激光多普勒測振儀上。在手術顯微鏡下通過微位移平臺來微調標本的位置將激光探頭的測試光點調整到基底膜的反光微珠上。把激光測振儀的輸出端連接到LMS數據采集系統,通過數據采集即可獲得基底膜的振動響應數據。

The right corner atlas in the circle was the amplified view under microscope.EAC:External auditory canal; LDV:Laser doppler vibrometer.

圖5測試裝置及測試過程示意圖

Fig 5The diagram of instruments and measurement process

結果

通過送聲器在外耳道處給予70 dB SPL的單頻聲激勵,頻率范圍為1 000～19 000 Hz。由于測試難度較大,實驗成功率不高,僅有7組數據符合測量要求,即信噪比達到10∶1。活體探索過程中均未能在活體時測得耳蝸基底膜的振動響應,因而數據均是離體樣本所得。且數據結果基本是在改進實驗方法之后獲得。

基底膜振動位移對頻率的函數見圖6,相位見圖7。可見基底膜的振動在5 kHz以下時比較平穩,之后緩慢上升,至11 kHz時達到最大值7.8 nm,之后迅速下降。相位呈兩段式下降,在1～10 kHz時,緩慢下降,從11 kHz開始迅速下降,最高頻率時達到了-1 400度左右。

討論

豚鼠的固定和解剖實驗中保持豚鼠在一固定的體位對實驗的順利進行十分重要。本文采用顳骨固定夾來固定豚鼠的頭部,收到一定的效果,但是比較耗時。文獻中使用的頭部固定架[8]可能是一種良好的固定方式。

如果采用文獻中描述的方法,即用特制的刀片將耳蝸骨壁逐漸刮薄之后再開孔,由于手術視野狹窄,活動空間有限,操作過程中較易損傷鼓膜及其他中耳結構。另外,所開的孔外形不規則 (圖2),而且操作過程中難免會有骨粉掉落至基底膜上,如不及時清理將無法測量。但是清理時往往難以避免損傷基底膜。本文的方法可以在磨削過程中避免碎骨片落入耳蝸內,從而影響其響應機制。

為了避免過強的噪聲和振動影響毛細胞功能,試驗中采用了耳科電鉆低速模式，并且通過逐漸打磨出一個環形孤島的方式來開孔。試驗中可以一次性將耳蝸骨壁打開,而快速、完好打開耳蝸骨壁避免了反復打磨耳蝸開孔的過程中損傷耳蝸基底膜。

反光微珠的放置既往文獻對反光微珠的放置有較多的描述,既有用微量移液器放置[13],也有用注射器尖端蘸取微珠然后將其放置在耳蝸基底膜上[12]。本實驗曾嘗試用微量移液器來放置微珠。但是實驗過程中很難保證一次吸入的微珠數量一致,因而難以保證放置在基底膜上的微珠數量一致。而且微量移液器的口徑較大,對如此微小的微球放置依然是一個龐大的器具,難以保證精確。而注射器尖端的口徑相對所開的耳蝸開孔來說過大,不適合微珠位置的調整。

另外,在放置反光微珠時鼓階內淋巴液的表面張力會使得放置十分困難。因此可以考慮在耳蝸淋巴液被吸干且自發產生的淋巴液尚未來得及補充時放置微珠[15],有待進一步的試驗驗證。

活體測量探索在活體測量探索的過程中未能解決耳蝸開孔處出血的問題,僅有1例樣本能達到活體耳蝸基底膜測量的要求,因而未能觀測到耳蝸基底膜的主動特性。通過吸出鼓階淋巴液并維持數分鐘的方法來防止血液流向基底膜,待出血控制后再讓耳蝸淋巴液自行補充[7],可能是一個較好的方法,也是進一步實驗可嘗試的手段。

采用本法可以快速、安全地進行耳蝸底旋骨壁開孔,并能避免反復磨削的骨粉落入耳蝸內,已成功測量了豚鼠基底膜的被動振動特性,因而可以作為一種較好的耳蝸基底膜振動測試的實驗方法。探索了離體耳蝸的實驗方法,但活體實驗中未能解決耳蝸開孔處出血的問題,所以活體耳蝸振動試驗是下一步研究的方向。

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欽倫秀,男,博士,外科教授、主任醫師、博士生導師。現任復旦大學附屬華山醫院院長助理兼外科主任、復旦大學腫瘤轉移研究所所長。國家杰出青年基金獲得者、長江學者特聘教授、教育部“肝癌轉移復發機制與防治策略創新團隊”帶頭人、國家重大科學研究計劃(973)首席科學家,享受國務院特殊津貼。為國際肝癌學會(ILCA)創始會員、國家自然基金委醫學部專家組成員,中國抗癌協會腫瘤轉移專業委員會主任委員、上海醫學會腫瘤靶分子專科委員會主任委員。為ClinExpMetastasis和ChinMedJ等14本雜志編委。

主要從事肝膽外科臨床工作和腫瘤轉移復發研究工作。每年手術治療肝膽腫瘤患者約500例(包括半肝、三葉切除,肝尾狀葉腫瘤,肝門脈膽管癌等各種高難度復雜手術),進行肝移植手術近百例。承擔國家科技重大專項肝癌項目(課題組負責人)、國家重大科學研究計劃(973)、863及國家自然科學基金國際合作重大項目等多項課題。發表SCI論文116篇, 發表的雜志包括Hepatology,Gut,CancerRes,Oncogene,ClinCancerRes,NewEnglJMed,Science,NatMed,Cancercell等。

主編專著《腫瘤的分子診斷與預測》(上海科技教育出版社,2004),為《現代腫瘤學》(第3版,復旦大學出版社,2011)和《肝癌轉移復發的基礎與臨床》(上海科技教育出版社,2003)等2本專著的副主編；參與7本專著的編寫(包括CancerMetastasis等3本英文專著)。

獲國家自然科學二等獎(2010)、上海市科技精英(2013)、上海市自然科學牡丹獎(2010)、上海市自然科學一等獎(2009)、教育部自然科學一等獎(2007)、國家科技進步一等獎(2006)、上海市自然科學二等獎(2000)和上海市衛生系統銀蛇獎等多項獎勵。先后二十余次在國際學術會議、三十余次在國內學術會議作特邀報告。擔任三屆“全國腫瘤轉移學術大會”主席及“首屆東方腫瘤分子診斷與治療學術大會”主席,并帶領中國抗癌協會腫瘤轉移專業委員會與國際腫瘤轉移研究會(MRS)聯合舉辦兩屆“國際腫瘤轉移學術大會”。

Testing methodology for the vibration in basilar membrane of guinea pig′s cochlea

ZHOU Lei1,XU Li-fu2,TA Na2,RAO Zhu-shi2,HUANG Xin-sheng1△

(1DepartmentofENT,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2InstituteofVibration,ShockandNoise-StateKeyLaboratoryofMechanicalSystemandVibration,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China.)

【Abstract】ObjectiveTo explore a method to measure the vibration in basilar membrane of guinea pig′s cochlea.MethodsGuinea pig was under pentobarbital anesthesia by intraperitoneal injection throughout the experiments.We made a ventrolateral incision and dissected the muscles.Then the bulla could be seen at the deep side of the mandible.The bulla was exposed by scraping the muscles on its surface,and was opened by electric drill.After the location of the basilar membrane was distinguished,a circle ditch was drilled gradually on corresponding bony wall.Then a fine hole of the bony wall could be done by openng this small piece isolated bony wall with a pointed scalpel.The reflected glass beads were placed on the basilar membrane using a pointed stainless needle.Then the laser doppler vibrometer (LDV) was used to record the vibration in basilar membrane under pure tone stimulation from the outer ear.ResultsWe measured the response curve of basilar membranem in guinea pig′s cochlea under sound stimulation of different frequencies.ConclusionsThis method can be used to measure the vibration in basilar membrane of guinea pig′s cochlea in vitro,while in vivotest may need further research.

【Key words】cochlea;basilar membrane;laser doppler vibrometer;guinea pig;vibration

【中圖分類號】R318.01; TB 532

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.013

(收稿日期:2015-04-10;編輯:王蔚)

國家自然科學基金 (81170910,11072145)

△Corresponding authorE-mail:huang.xinsheng@zs-hospital.sh.cn