β細胞素下調對肝癌細胞增殖能力的影響及其機制探討*

第四軍醫大學西京醫院肝膽胰脾外科(西安710032)　李　軍　白　娟　竇科峰　安家澤

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β細胞素下調對肝癌細胞增殖能力的影響及其機制探討*

第四軍醫大學西京醫院肝膽胰脾外科(西安710032)李軍△白娟◇竇科峰安家澤▲

摘要目的：在肝癌細胞系中通過下調β細胞素 (BTC)的表達研究其對肝癌細胞侵襲能力的影響并探究其影響機制。方法：通過siRNA轉染下調BTC后,通過Transwell侵襲實驗檢測SMMC7721和MHCC97-H細胞的侵襲能力變化，并用RT-PCR和Western blot檢測與肝癌侵襲能力相關的PI3K/AKT-XIAP信號通路的表達變化。結果：與陰性對照組相比,siRNA下調組中SMMC7721和MHCC97-H細胞的侵襲能力明顯降低，PI3K/AKT-XIAP信號通路受到明顯抑制。結論：下調BTC表達可能通過抑制PI3K/AKT-XIAP信號通路抑制肝癌細胞的侵襲能力。

主題詞肝腫瘤細胞增殖 β細胞素 腫瘤抑制蛋白質類

肝癌是目前世界范圍內發病率居第6位[1]，致死率居第2位的惡性腫瘤。我國的肝癌形勢尤為嚴峻，占全球肝癌發病人數和死亡人數的一半以上[2]。為改善肝癌治療現狀，肝癌侵襲、轉移機制一直是研究的熱點問題。作為表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor,EGF)家族中的一個成員,β細胞素(Betacellulin,BTC)在腫瘤的機制研究中日益受到重視,BTC在肝癌、胰腺癌、子宮內膜癌組織中都有較高的表達[3]。本課題組前期的研究發現BTC的高表達與肝癌組織的病理特征密切相關，提示BTC與肝癌的侵襲、轉移相關[3]。但目前關于BTC調控肝癌侵襲、轉移的機制尚不清楚。因此,本研究通過siRNA轉染的方式在肝癌細胞系MHCC97-H和SMCC7721中下調BTC的表達,進而研究下調BTC對肝癌細胞侵襲能力的影響并進行機制探索。

材料和方法

1材料①肝癌細胞系：人肝癌細胞系SMMC-7721、MHCC97-H。②實驗試劑：DMEM培養基；磷酸緩沖液(PBS)；FBS；0.25%胰蛋白酶；DMSO；注射用鏈霉素粉針劑；注射用氨芐青霉素粉針劑；重組人BTC蛋白。BTC inhibitors 及其陰性對照NC，脂質體2000。反轉錄試劑盒、DEPC純水；rTaq酶、Trizol(美國Invitrogen公司)；DNA marker、DNA Loading buffer(中國大連Takara公司)，SYBRPremix EX Taq熒光實時定量(RT)試劑盒；三氯甲烷、二甲基甲醇、99.97%的Alcohol(天津永大化學制劑公司)；瓊膠糖(上海澤邁生物技術有限公司)。鼠抗人BTC多克隆一抗(美國Cell Signaling Technology試劑公司);鼠抗人β-actin多克隆一抗(美國Cell Signaling Technology試劑公司)；鼠抗人MMP-2多克隆一抗(美國Cell Signaling Technology試劑公司)，鼠抗人MMP-9多克隆一抗(美國Cell Signaling Technology試劑公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(美 國 Cell Signaling Technology試劑公司)；鼠抗IXAP多克隆一抗(美國Cell Signaling Technology試劑公司)；細胞裂解液；硝酸纖維膜(Millipore 中國有限公司)；5X蛋白上樣緩沖液(中國)； 10X電泳緩沖液；TBS-T漂洗液。Matrigel膠(BD公司)；transwell小室(美國Millipore公司)。

2方法①細胞培養：肝癌細胞株SMMC7721和MHCC97-H在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養基中于5% CO2、37℃恒溫培養箱中培養。②RT-PCR：mRNA提取采用Takara公司RNAiso Plus(Total RNA提取試劑) 并按其說明進行操作，反轉錄采用Takara公司反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix并按其說明書進行操作，RT-PCR在Bio-Rad公司IQ5 實時定量PCR儀上進行，采用Takara公司的PCR試劑盒SYBR Premix EX TaqTMII并按其說明進行操作。所用到的引物序列(5’-3’)：BTC正CCTGGGTCTAGTGATCCTTCA, BTC反CTTTCCGCTTTGATTGTGTGG，XIAP正GGG AAC AAC ATGCTAAATGG，XIAP反CTGCAACCAGAACCT CAAGT，β-actin正CATGTACGTTGCTATCCAGGC，β-actin反CTCCTTAATGTCACGCACGAT。③Western blot：取鋪滿培養皿底約80%～90%的細胞，4℃PBS清洗后加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細胞，12000rpm離心10min吸取上清，留樣測定蛋白濃度，其余加入等體積2XSDS蛋白上樣緩沖液并煮沸5min準備電泳。按照碧云天公司蛋白凝膠配置試劑盒說明書配膠并上樣，120V電泳結束后以橫流170 mA,2 h的條件濕轉蛋白至PVDF膜,含5%BSA的TBST封閉1 h，按說明書建議濃度稀釋一抗并于 4℃搖床搖晃過夜孵育,TBST洗滌5min×3次,以辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下緩慢搖晃孵育1h，TBST洗滌5 min×3次。使用Millipore公司增強型ECL化學發光試劑盒在Bio-RAD公司ChemicalDocTM XRS+顯影儀上發光顯影,并用Image Lab軟件對圖像進行分析。④siRNA轉染：轉染分為3組：FAM-對照組：轉染時加FAM -inhibitors control+脂質體2000，該組用來檢測轉染效率，不再進行后續實驗；實驗組：轉染時加入BTC inhibitors(IB)+脂質體2000；陰性對照組：轉染時加入陰性對照inhibitors(NC)+脂質體2000。以上轉染試劑均購自吉瑪公司。轉染流程如下：胰酶消化細胞并接種至6孔板，培養至細胞融合達到60%～80%時,棄去培養液，將150 pmol inhibitors和5μl 脂質體2000加入250μl的無血清DMEM培養液分別進行稀釋,充分混勻后室溫靜置5 min。將兩種稀釋液混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板。經過6 h培養后，更換完全培養基繼續培養待用。⑤Transwell侵襲實驗：以不含血清的DMEM培養基按1∶5稀釋Matrigel 膠，均勻包被于Transwell小室膜上，室溫凝膠后吸出上清，將小室置入含200μl完全培養基的96孔板中。將siRNA轉染后的細胞進行消化、洗滌并離心后，無血清培養液重懸，調整細胞濃度為1×105/ml,吸取200μl細胞懸液加入上室。常規培養24 h后，PBS淋洗小室，棉簽輕柔擦拭膜內層細胞,無水酒精固定5 min后,結晶紫染色30min。將Transwell小室倒置于顯微鏡下,在200倍鏡下隨機選取5個視野,計數穿孔細胞。

結果

1肝臟細胞系和肝癌細胞系中BTC的表達情況見圖1。RT-PCR檢測人肝臟細胞系HL-7702和肝癌細胞系Huh7、HepG2、SMCC7721和MHCC97-H中BTC的mRNA表達情況，四種肝癌細胞系中BTC的mRNA表達量均高于肝臟細胞系(P<0.05),并且在侵襲能力更高的SMCC7721和MHCC97-H細胞系中BTC的表達量更高。Western blot檢測BTC蛋白表達也得到一致結果。選擇BTC高表達的SMCC7721和MHCC97-H進行下一步siRNA轉染。

RT-PCR(A)和Western blot(B)示BTC在肝臟細胞系HL-7702和肝癌細胞系Huh7、HepG2、SMMC7721和MHCC97-H中的表達(*P<0.05,***P<0.001)

圖1肝臟細胞系和肝癌細胞系中BTC的表達情況

2轉染siRNA后SMCC7721和MHCC97-H細胞中BTC的表達變化見圖2。與對照組相比，實驗組的兩種細胞BTC mRNA和蛋白含量均顯著下調(P<0.001)。PCR所示SMCC7721和MHCC97-H中Tg737的敲減率分別為61.73%和63.44%。

(***P<0.001)

圖2 PCR(A)和Western blot(B)示轉染siRNA下調Tg737的結果

3下調BTC對SMMC-7721和MHCC97-H細胞侵襲能力的影響見圖3。通過Transewell侵襲實驗檢測發現， siRNA下調BTC的表達后，SMMC7721和MHCC97-H細胞的侵襲能力明顯下降(P<0.01)。

(**P<0.01)

4下調BTC通過抑制AKT-XIAP通路降低SMMC7721和MHCC97-H的侵襲能力 見圖4。檢測轉染siRNA后SMMC7721和MHCC97-H細胞中XIAP的mRNA和蛋白表達水平，發現XIAP的表達明顯降低(P<0.05)。Western blot檢測發現，與對照組相比，實驗組SMMC7721和MHCC97-H中磷酸化的AKT蛋白減少，同時AKT蛋白的表達沒有變化。

(*P<0.05)

討論

人BTC基因定位于4號染色體長臂上,其cDNA 全長為1.3 kB,其開放讀碼框共編碼178 個氨基酸形成BTC前體蛋白。成熟人BTC 為糖蛋白，由80 個氨基酸組成，分子量為18 kD。它首先由Song等[4]從小鼠胰腺β細胞瘤細胞中發現并成功克隆，在胰腺、肝臟、腎臟等組織中都有較高表達。作為促癌因子EGF家族的一員，BTC主要與EGF受體家族中的ERBB-1 ( EGFR) 、ERBB-4同源二聚體結合,與ERBB-1、2、3、4 相互形成的異二聚體也有較低的親和性[5]。因此，BTC也被與腫瘤聯系起來。在肝癌、胰腺癌、子宮內膜癌組織中都檢測到了BTC蛋白的高表達。我們課題組前期的研究中也發現BTC蛋白的高表達與肝癌的病例特征密切相關，提示BTC與肝癌的侵襲轉移能力相關。

檢測正常肝臟細胞系HL-7702和四種肝癌細胞系中BTC的mRNA和蛋白表達我們發現，BTC在肝癌細胞系中的表達明顯高于正常肝臟細胞系,并且隨著肝癌細胞系侵襲能力的增強呈現出表達升高的趨勢，提示BTC的高表達與肝癌細胞的侵襲能力密切相關。因此,我們通過siRNA轉染的方式在高表達BTC的SMMC7721和MHCC97-H細胞系中下調BTC的表達并檢測侵襲能力發現,下調BTC明顯抑制了肝癌細胞的侵襲能力,但是其中的分子機制尚不清楚。

作為EGF家族的一員，BTC與其配體的結合可以激活細胞內的PI3K/AKT通路[6]。對PI3 K/AKT信號轉導通路的研究表明，PI3K/AKT信號轉導通路的激活可以通過促進金屬蛋白酶的分泌[7],提高腫瘤細胞的侵襲能力，還可以促進細胞內X 染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(XIAP)的表達[8]。作為凋亡抑制蛋白(IAP)家族的一員,XIAP可以增強肝癌細胞的侵襲能力，而且XIAP在肝癌組織中的高表達與肝癌的轉移能力密切相關[9]。那么，BTC與其配體的結合是否可以通過PI3K/AKT通路來促進XIAP的表達并進而促進肝癌細胞的侵襲能力呢？通過檢測siRNA下調BTC后SMCC7721和MHCC97-H細胞中AKT、p-AKT和XIAP的表達我們發現，下調BTC可以抑制AKT的磷酸化并降低XIAP的表達，說明下調BTC可能是通過抑制PI3K/AKT-XIAP通路來抑制肝癌細胞的侵襲能力。

至此,我們通過siRNA下調肝癌細胞系SMMC7721和MHCC97-H中BTC的方式,說明了BTC下調可以通過PI3K/AKT通路抑制XIAP的表達,進而抑制肝癌細胞的侵襲能力,揭示了BTC調控

肝癌侵襲能力的分子機制，也為BTC靶向治療肝癌的開展找到了有力證據。

參考文獻

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(收稿：2016-01-11)

Down-regulation of betacellulin expression inhibits invasion of hepatocellular carcinoma cell through repression of PI3K/AKT pathway Department of Hepatobiliary & Pancreas Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University

(Xi’an 710032) Li JunBai JuanDou Kefenget al

ABSTRACTObjective: To study the influence of betacellulin(BTC) down-regulation on invasion of hepatocellular carcinoma(HCC) cells and to explore its mechanism. Methods: After down-regulating the expression of BTC through siRNA transfection, the invasion ability of SMMC7721 and MHCC97-H cells were respectively measured by transwell invasion assay, and the PI3K/AKT-XIAP pathway that associated with the invasion of HCC were detected by RT-PCR and Western blot. Results: The invasion capacity of SMMC7721 and MHCC97-H cells were significantly inhibited through down-regulation of gene BTC, along with the PI3K/AKT-XIAP pathway. Conclusion: Down-regulation of BTC expression inhibits the invasion of SMMC7721 and MHCC97-H cells through the repression of PI3K/AKT-XIAP pathway.

KEY WORDSLiver neoplasmsCell proliferationBetacellulinTumor suppressor proteins

【中圖分類號】R735.7

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.001

·論著·基礎研究·

*國家自然科學基金重點項目(81030010)

陜西省社會發展公關計劃項目[2009K12-02(9)]

△陜西省府谷縣人民醫院普外科

◇陜西省榆林市星元醫院內二科

▲通訊作者