白藜蘆醇對熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中HIF-1α和VEGF表達的抑制作用*

西安醫學院第一附屬醫院普外科(西安 710077)　李武軍　 于　良　吳勝利

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白藜蘆醇對熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中HIF-1α和VEGF表達的抑制作用*

西安醫學院第一附屬醫院普外科(西安 710077)李武軍 于良△吳勝利△

摘要目的：探討白藜蘆醇對熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中HIF-1α和VEGF表達的抑制作用。方法：選取24只大鼠隨機分為對照組,模型組和白藜蘆醇處理組各8只,通過肝門動脈阻斷1 h后再灌注1 h來建立缺血再灌注模型,白藜蘆醇處理組在缺血再灌注前進行白藜蘆醇20 mg/kg預處理30 min。建模后檢測血清中ALT、ALP和TBIL的含量變化；肝臟中HIF-1α和VEGF表達通過RT-PCR和Western blot來檢測。結果：與對照組相比,模型組大鼠血清中ALT、ALP和TBIL的含量及肝臟中HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達量均顯著上升(P<0.05)；與模型組相比,白藜蘆醇20 mg/kg預處理后大鼠血清中ALT、ALP和TBIL的含量及肝臟中HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達量均顯著下調(P<0.05)。結論：白藜蘆醇對熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中HIF-1α和VEGF表達具有抑制作用；因此，HIF-1α/VEGF可能是白藜蘆醇在肝臟腫瘤中起抗癌作用的一個藥物靶點。

主題詞再灌注損傷熱缺血 缺氧誘導因子1血管內皮生長因子@白藜蘆醇

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一種最常見的惡性腫瘤,肝切除和肝移植是常用的治療手法，而治療后的腫瘤復發及轉移仍是目前面臨的一個主要問題。肝臟缺血再灌注損傷(Hepatic ischemia/reperfusion injury,HIRI)是肝臟外科手術、休克復蘇、嚴重肝外傷、肝臟移植等過程中經常會出現的病理過程；HIRI可能通過激活細胞入侵及血管生成等途徑來促進肝臟腫瘤的生長和轉移,嚴重影響患者的預后[1]。缺氧誘導因子1α(Hypoxiainducible factor-1 alpha,HIF-1α)是缺氧/缺血的主要調節因子。研究表明,HIRI引發的肝腫瘤轉移可能與HIRI后HIF-1α的表達上調相關[2]。HIF-1α可以刺激血管內皮生成因子(Angiogenic vascular endothelial growth factor,VEGF),已有研究證明HIF-1α/VEGF通路與多種腫瘤的發展相關[3]。白藜蘆醇(RES)是一種具有抗癌活性的多酚類植物抗毒素,通過影響與腫瘤發生、發展相關的細胞事件來發揮抗腫瘤作用[4]；近期研究表明RES具有抑制血管生成的作用,但其機制有待進一步探討[5]。本研究旨在探討RES是否可以抑制缺血再灌注損傷(I/R)誘導的HIF-1α和VEGF表達,為RES成為HCC病人手術后減少腫瘤復發和轉移的新藥物提供理論依據。

材料與方法

1實驗試劑RES和DMSO購自美國Sigma公司,RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司。RES用DMSO溶解后用RPMI-1640進行稀釋,終濃度為4 mg/ml。SD大鼠由西安交通大學實驗動物中心提供(周齡9～10周,體重190～210 g)。

2動物分組及模型建立24只大鼠隨機分為3組各8只，所有大鼠在實驗前禁食12 h，自由進水。戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉(50 mg/kg)。對照組，腹部切開6 cm切口以充分暴露肝臟，整個切口保持60 min,不進行肝缺血手術,隨后關腹。模型組：腹部切開6 cm切口以充分暴露肝臟，用動脈夾夾閉肝門,1 h后開放,隨后關腹,于1 h后取樣。RES預處理組：在建模前30 min通過尾靜脈注射RES(20 mg/kg);其余同模型組。模型組在建模前30 min通過尾靜脈注射生理鹽水(20 mg/kg)。

3樣品采集所有大鼠在再灌注1 h后注射戊巴比妥(100 mg/kg IV)處死，假手術組也同時處死，收集肝臟組織及下腔靜脈血。靜脈血經4℃ 4000 r/min離心3 min取血清備用；肝臟組織在液氮中保存備用。

4血清中各指標的檢測谷丙轉氨酶(AL)，膽紅素(TBIL)，堿性磷酸酶(ALP)檢測采用羅氏相關試劑盒,利用日立AU5400自動生化分析儀(Hitachi Corp.,日本)進行分析。

5RT-PCR采用TRozlo法提取肝臟中總RNA并進行反轉錄得到cDNA,β-actin作為內參基因。HIF-1α的引物序列為：sense 5’-ACTGCACAGGCCACATTCAT-3’,antisense 5’-CGAGGCTGTGTCGACTGAGA-3’；VEGF的引物序列為：sense 5’-AGGCGAGGCAGCTTGAGTTA-3’antisense5’-CTGTCGACGGTGACGATGGT-3’；β-actin的引物序列為：5’-CCTAGGCACCAGGGTGTGAT-3’,antisense5’-TTGGTGACAATGCCGTGTTC-3’。RT-PCR的步驟為95℃預處理3 min；95℃變性10 s,55℃退火30 s,60 ℃延伸1 min,進行39個循環后72 ℃延伸10 min后4 ℃保存備用。

6Western blot利用試劑盒提取肝臟組織總蛋白并進行定量,β-actin作為內參,樣品經過SDS-PAGE后轉移至醋酸纖維膜上,封閉60min后在一抗(1∶3000)中4℃孵化過夜,洗膜后與二抗(抗鼠IgG，1∶6000)中室溫孵化120 min；之后洗膜并利用化學發光檢測試劑盒進行檢測(Amersham, Piscataway, NJ, USA),分析采用BioSpectrum500凝膠成像系統進行(UVP, Upland, CA, USA)。本實驗所用所有抗體均購自美國Sigma公司。

7統計學方法本研究所有數據均采用SPSS 16.0統計學軟件進行統計分析,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)進行,P<0.05表示差異具有統計學意義。

結果

1肝功能檢測結果見附表。與對照組相比，缺血再灌注后血清中ALT、ALP和TBIL含量均顯著上調(P均<0.05)；而經過RES 20 mg/kg預處理后,與模型組相比,缺血再灌注誘導的這種血清中ALT、ALP和TBIL含量上升得到顯著抑制(P均<0.05)。

附表　各組生化指標的檢測結果

注：與對照組相比,*P<0.05；與模型組相比,#P<0.05

2HIF-1α表達變化情況見圖1。與對照組相比，缺血再灌注后肝臟組織中HIF-1α的表達量在mRNA和蛋白水平上均顯著上調(P均<0.05)；而經過RES 20 mg/kg預處理后，與模型組相比，缺血再灌注誘導的HIF-1α的表達量上升得到顯著抑制(P均<0.05)。

A：HIF-1α mRNA的RT-PCR檢測結果(與模型組相比,*P<0.05)；B：HIF-1α蛋白水平的Western blot檢測結果，β-actin作為內參

圖1大鼠肝臟中HIF-1α的表達

3VEGF表達變化情況見圖2。與對照組相比，缺血再灌注后肝臟組織中VEGF的表達量在mRNA和蛋白水平上均顯著上調(P均<0.05)；而經過RES 20 mg/kg預處理后，與模型組相比，缺血再灌注誘導的VEGF的表達量上升得到顯著抑制(P均<0.05)。

A： VEGF mRNA的RT-PCR檢測結果(與模型組相比,*P<0.05)； B：VEGF蛋白水平的Western blot檢測結果，β-actin作為內參

圖2大鼠肝臟中VEGF的表達

討論

HIRI可能會導致肝臟結構性和代謝性的損傷，是肝移植和肝臟外科手術后所面臨的一個主要問題。HIRI對機體造成的傷害可能與線粒體釋放、5-三磷酸腺苷損耗、電解質平衡的改變、Kupffer細胞激活、氧化應激及促炎癥因子表達的上調等多種因素相關[6]。在I/R引發的缺氧狀態下，細胞可通過調節HIF-1的表達來保護肝臟。HIF-1家族包括HIF-1α和HIF-1β兩個亞族，HIF-1α在1992年首次由Semenza發現并報道，其研究結果顯示，低氧環境可調控HIF-1α的表達但對HIF-1β的表達無影響[7]；當機體處于氧飽和狀態時，HIF-1α會在細胞質中通過泛素途徑降解。在缺氧條件下，HIF-1α降解受阻，使得細胞內HIF-1α得到積累并運輸到細胞核內與HIF-1β結合形成同源復合體后與目標基因啟動子區的低氧應答組件結合激活包括VEGF、促紅細胞生成素、糖酵解酶、轉鐵蛋白等與缺氧條件下細胞自我保護相關基因的轉錄。

VEGF是HIF-1α下游的直接調控基因，通過促進血管內皮細胞的增殖，抑制血管內皮細胞的凋亡和促進血管的形成等途徑在腫瘤血管再生中起重要作用，此外,VEGF還可以促進一種公認的可啟動肝臟再生的肝細胞生長因子(HGF)的表達。綜上,肝臟局部缺血后HIF-1α的表達可能存在雙重作用,一方面保護肝臟免受I/R帶來的損傷，另一方面可能通過調節血管再生促進HCC的復發和轉移。

RES是一種環氧化酶抑制劑,具有抗氧化、抗血小板活性及抗炎癥的作用[8]。研究表明，RES可以通過其抗氧化活性及清除再灌注后產生的自由基的方式來保護肝臟免受I/R帶來的損傷。近年來有學者發現RES具有抗腫瘤血管生成的作用，但其機制有待進一步探討。有研究顯示RES可以通過NF-kappa B途徑抑制HepG2細胞中VEGF的表達；RES可通過抑制AKT和促分裂原活化蛋白激酶活性抑制HIF-1α和VEGF的表達及通過蛋白酶體途徑促進HIF-1α的降解來抑制人卵巢癌的發生和血管生成[9]。

本研究結果顯示,與對照組相比,缺血再灌注后血清中ALT,ALP和TBIL含量均顯著上調；而經過RES 20 mg/kg預處理后,與模型組相比,缺血再灌注誘導的這種血清中ALT,ALP和TBIL含量上升得到顯著抑制。與對照組相比,缺血再灌注后肝臟組織中HIF-1α和VEGF的表達量在mRNA和蛋白水平上均顯著上調；而經過RES 20 mg/kg預處理后,與模型組相比,缺血再灌注誘導的HIF-1α和VEGF的表達量上升得到顯著抑制。進一步證實了RES在肝臟I/R后對肝臟的保護作用；除此以外，我們首次在體內試驗中證實了RES具有抗血管生成的作用；提示我們，RES抗血管生成的部分機制可能是抑制HIF-1α和VEGF的表達；但RES調控HIF-1α和VEGF表達的機制有待進一步研究。

綜上所述，RES在熱缺血/再灌注后大鼠肝臟中通過抑制HIF-1α和VEGF的表達來發揮抗血管生成的作用。HIF-1α/VEGF作為腫瘤生長和轉移的重要調控因子,可能是白藜蘆醇在肝臟腫瘤中起抗癌作用的一個藥物靶點。

參考文獻

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(收稿：2015-12-07)

The suppressive effects of resveratrol on HIF-1α and VEGF expression after warm ischemia and reperfusion in rats liver Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University(Xi’an 710077)

Li WujunYu Liang Wu Shengli

ABSTRACTObjective: The aim of the present study was to investigate the effects of resveratrol (RES) on the expression of ischemic-induced HIF-1α and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rats liver. Methods: Twenty-four rats were randomized into Sham, ischemia/reperfusion (I/R), and RES preconditioning groups. I/R was induced by portal pedicle clamping for 60 minutes followed by reperfusion for 60 minutes. The rats in RES group underwent the same surgical procedure as I/R group, and received 20 mg/kg resveratrol intravenously 30 min prior to ischemia. Blood and liver tissue samples were collected and subjected to biochemical assays, RT-PCR, and Western blot assays. Results: I/R resulted in a significant (P<0.05) increase in serum biochemical parameters and liver HIF-1α and VEGF at both mRNA and protein levels 60 minutes after reperfusion. The serum biochemical parameters and the mRNA and protein expressions of HIF-1α and VEGF decreased significantly in RES group when compared to I/R group (P<0.05). Conclusion: The inhibiting effects of RES on the expressions of HIF-1α and VEGF induced by I/R in rats liver suggested that HIF-1α/VEGF can be a promising drug target for RES in the development of an effective anticancer therapy for the prevention of hepatic tumor growth and metastasis.

KEY WORDSReperfusion injury Warm ischemiaHypoxia-inducible factor 1Vascular endothelial growth factors@Resveratrol

【中圖分類號】R735.7

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.002

*陜西省教育廳科學研究計劃項目(11JK0710)

△西安交通大學第一附屬醫院