埃博拉病毒進入抑制劑篩選模型的建立與應用

王靜，陳淑敏，馬鈴，張瑞欣，李卓榮，余利巖，岑山

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埃博拉病毒進入抑制劑篩選模型的建立與應用

王靜，陳淑敏，馬鈴，張瑞欣，李卓榮，余利巖，岑山

【摘要】

目的旨在以埃博拉病毒（EBOV）包膜糖蛋白（GP）為靶點，建立埃博拉病毒進入抑制劑高通量篩選模型，應用該模型篩選具有特異性抑制埃博拉病毒進入的活性樣品。

方法利用細胞水平重組病毒技術(shù)，分別用兩株不同爆發(fā)時間的 Zaire-EBOV 的 GP 與 HIV 核心質(zhì)粒（pNL4-3.Luc）共表達，制備重組病毒 EBOV-GP-Old/HIV-luc 和EBOV-GP-New/HIV-luc。利用 ELISA 和熒光素酶檢測技術(shù)，優(yōu)化病毒產(chǎn)量、感染性、感染劑量及熒光活性測定時間等因素，建立藥物篩選模型。利用統(tǒng)計學參數(shù)及陽性化合物評估該模型的穩(wěn)定性和靈敏性。應用該模型，對 242 個樣品進行初步篩選，并通過與水泡性口膜炎病毒包膜蛋白包裝的重組病毒 VSVG/HIV-luc 進行比較，以判斷樣品的特異性。

結(jié)果該模型可用于靶向 GP 蛋白的埃博拉病毒進入抑制劑的高通量篩選，并獲得 4 種具有特異性抗埃博拉進入活性的樣品。

結(jié)論該模型可用于抗 EBOV 進入藥物的高通量篩選，應用該模型獲得的陽性樣品有助于抗 EBOV 藥物的發(fā)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】埃博拉病毒；高通量篩選分析；進入抑制劑

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):193-199

作者單位：100050 北京，中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學室

據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，2014 年 3 月由扎伊爾埃博拉病毒（Zaire-EBOV）引起的西非疫情是自1976 年首次發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒以來發(fā)生的最大一輪埃博拉疫情。埃博拉病毒為單股負鏈 RNA 病毒，屬于絲狀病毒科（Filoviridae）。人感染埃博拉病毒后，主要臨床表現(xiàn)為急性發(fā)熱、肌肉酸痛、頭痛、嘔吐及肝臟、腎臟受損或有出血等癥狀［1］。其中扎伊爾型埃博拉病毒致病力最強，且致死率高達90%［2］。迄今還沒有被 FDA 批準的疫苗和藥物來預防和治療埃博拉病毒。因此，尋找新的抗埃博拉病毒藥物至關(guān)重要。由于 EBOV 的高致病性和致死率，對有感染性的埃博拉病毒的研究就只能限定生物安全級別最高的 BSL-4 級實驗室中進行，使得依賴于野生型 EBOV 的藥物篩選難以實現(xiàn)［3］。

隨著基于微型基因組（minigenome）的復制子及復制缺陷的假病毒報告系統(tǒng)迅速發(fā)展，抗病毒化合物的快速篩選得以在生物安全 BSL-2 級實驗室中進行［4-5］。病毒的細胞進入階段是病毒復制周期中的重要時期，在病毒感染早期抑制病毒的進入可以減少病毒感染的幾率，同時也可降低藥物耐藥性的發(fā)生。因此，病毒的進入階段成為篩選抗病毒藥物的重要靶點。EBOV 基因組長 18.9 kb，編碼七種病毒蛋白，其中 EBOV-GP 是唯一負責病毒進入宿主細胞的蛋白。盡管以 EBOV-GP 蛋白為靶點的抗埃博拉病毒進入藥物篩選模型已有報道，但均以此前的流行株為基礎(chǔ)。2014 年埃博拉病毒的大規(guī)模爆發(fā)表明病毒的遺傳變異改變了其傳播和致病能力。根據(jù)蛋白序列比對，1976 年經(jīng)典株與 2014 年流行株的 EBOV-GP 蛋白有 19 個氨基酸位點發(fā)生了突變。因此，為了提高研發(fā)藥物的針對性，本文將分別以埃博拉病毒經(jīng)典株和流行株的表面包膜糖蛋白為外膜蛋白包裹 HIV 核心制備復制缺陷型假病毒 HIV/EBOV-GP，通過熒光報告基因檢測技術(shù)來判斷樣品的抗病毒活性，從而建立以EBOV-GP 蛋白為靶點的病毒進入抑制劑高通量篩選模型，并期望應用該模型獲得特異性好的埃博拉病毒進入抑制劑。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品格爾德霉素及其衍生物樣品由本所合成室提供；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物和天然產(chǎn)物樣品由本所藥用微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2細胞和質(zhì)粒293T 細胞為本實驗室自有；Zaire-EBOV 包膜糖蛋白GP 基因 EBOV-GP-New （GIN/2014/Gueckedou-C07）由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；EBOV-GP（COD/1976/Yambuku-Mayinga）由加拿大 McGill 大學 Chen Liang 教授惠贈，后由本實驗室克隆改造為 EBOV-GP-Old；攜帶熒光素酶報告基因的 HIV-luc 質(zhì)粒（pNL4-3.Luc.Eˉ）和水泡性口膜炎病毒外殼糖蛋白（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G）質(zhì)粒為本實驗室保存。

1.1.3試劑和儀器DMEM、含 EDTA 的 0.25%胰酶、FBS 和 DNA 轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000購自美國 Invitrogen 公司；熒光素酶活性測定試劑盒及細胞裂解液購自美國 Promega 公司；人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；兔抗 FLAG標簽抗體購自美國 Sigma 公司；鼠抗 β-actin 抗體購自英國 Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；Centro XS3LB 960 型酶標儀為德國 Berthold 公司產(chǎn)品；680 型microplate reader 酶標儀、PowerPacTMHC Power Supply 蛋白電泳儀、Mini Trans-Blot 蛋白轉(zhuǎn)膜儀及Gel DocTMXR+凝膠成像儀均為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1埃博拉病毒 GP 蛋白的表達檢測根據(jù)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將EBOV-GP-New 或 EBOV-GP-Old 與 pNL4-3.Luc.Eˉ質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至 293T 細胞，同時將轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+） 與 pNL4-3.Luc.Eˉ質(zhì)粒的 293T 細胞作為陰性對照。培養(yǎng) 48 h 后 RIPA 裂解細胞，冰置 30 min 后于 4 ℃、13 000 r/min 離心 10 min，收集上清液，按常規(guī) Western blot 方法檢測 GP 蛋白的表達，以內(nèi)源 β-actin 蛋白表達為內(nèi)參對照。

1.2.2假型病毒產(chǎn)量及感染性測定將細胞按 2 × 105/ml 濃度鋪六孔板，24 h 后將 300 ng pNL-Luc-Eˉ和不同劑量（100、200、400、800、1600 ng）的EBOV-GP-New 或 EBOV-GP-Old 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞。48 h 后收取上清病毒液，0.45 μm 濾膜過濾。取部分病毒液按照人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒說明書進行病毒產(chǎn)量的測定。

將病毒液按不同稀釋比感染已鋪于 96 孔板中的 293T 細胞（細胞濃度為 2 × 105/ml），放入細胞培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)。48 h 后吸去上清液，加入 100 μl 的 1 × 細胞裂解液于 37 ℃ 裂解細胞。30 min 后吸取 10 μl 細胞裂解液與 40 μl 熒光素酶底物溶液混勻，利用酶標儀測定熒光素酶活性。

1.2.3高通量篩選流程及模型評價按 2 × 105/ml 接種 293T 細胞至 96 孔板中，培養(yǎng) 24 h后，將樣品與 293T 細胞于 37 ℃ 細胞培養(yǎng)箱預孵育 1 h 后加入病毒液，以溶劑 DMSO 為空白對照，每組設立三個平行對照。細胞培養(yǎng) 48 h 后測定細胞熒光素酶活性，并計算樣品對病毒的抑制率。為了對本篩選模型的穩(wěn)定性以及本模型是否適合高通量篩選進行判斷，按照生物技術(shù)高通量篩選模型通用的統(tǒng)計學原理的方法來計算 Z' 因子和變異系數(shù)（%CV）［6］。

1.2.4陽性化合物量效關(guān)系的確定按照上述相同方法，用不同濃度的陽性化合物粉防己堿（0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8、2、4 μmol/L）處理細胞，并以溶劑 DMSO 作為對照組，每組設立三個平行對照，通過測定熒光素酶活性計算陽性化合物半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.5樣品初篩及活性樣品特異性分析初篩樣品（格爾德霉素及其衍生物的作用濃度為 20 μmol/L，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物的作用濃度為 1 mg/ml 和 10 μmol/L，天然產(chǎn)物的作用濃度為 15 μmol/L 或 10 μg/ml）的病毒抑制率通過上述高通量篩選流程及熒光素酶測定方法獲得。選取活性樣品，比較在 HIV-luc/EBOV-GP 與模型對照組 HIV-luc/VSVG 中的檢測結(jié)果，進行樣品特異性評價。

2　結(jié)果

2.1扎伊爾型埃博拉重組病毒感染性分析方法測試

2.1.1編碼 EBOV-GP-New 和 EBOV-GP-Old基因的質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)文獻［7］報道，在 NCBI 中查找扎伊爾型埃博拉病毒流行株的基因組序列（Genbank KJ660347，2031 bp），利用基因合成技術(shù)，成功將帶 FLAG 標簽的 GP 基因克隆至真核表達載體 pcDNA3.1（+） 中，命名為 EBOV-GP-New。同時將本室現(xiàn)有的 GP 質(zhì)粒（RefSeq NC_002549.1，2031 bp）亞克隆至 pcDNA3.1（+） 載體中，命名為EBOV-GP-Old。上述兩種質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定序列正確，構(gòu)建示意圖如圖1A 所示。

圖1　Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒感染性測試［A：Zaire-EBOV 的 GP 基因示意圖；B：Zaire-EBOV GP 蛋白表達鑒定（1：EBOV-GP-Old；2：EBOV-GP-New；3：pcDNA3.1（+））；C：Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒感染后的熒光素酶活性測定（1：pcDNA3.1（+）；2：EBOV-GP-Old；3：EBOV-GP-New）］Figure 1　Test of Zaire-EBOV GP/HIV-luc pseudovirions infectivity ［A： Schematic representation of Zaire-EBOV GP genes； B：Identification of Zaire-EBOV GP expression （1： EBOV-GP-Old； 2： EBOV-GP-New； 3： pcDNA3.1（+））； C： Luciferase activity was determined 48 h post-infection （1： pcDNA3.1（+）； 2： EBOV-GP-Old； 3： EBOV-GP-New）］

圖2　GP 蛋白對 Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒的產(chǎn)量及感染性的影響（A：Western blot 檢測 GP 蛋白的表達情況；B：ELISA 技術(shù)檢測 GP 蛋白對病毒產(chǎn)量的影響；C：通過等量假病毒感染 293T 細胞后測定熒光素酶活性來檢測 GP 蛋白對病毒感染性的影響）Figure 2　Effect of GP expression on the production and infectivity of Zaire-EBOV GP/HIV-luc pseudovirus （A： The expression of GP and β-actin were detected by Western blot； B： The pseudoviral supernatants were used to determined the p24 level by ELISA kit；C： Equal amounts of pseudovirus were infected 293T cells and 48 h later， luciferase activity was determined）

2.1.2GP 蛋白的表達鑒定及 Luc 活性檢測在293T 細胞中共表達pNL4-3.Luc.Eˉ與EBOV-GP-Old 或 EBOV-GP-New，利用 Western blot 實驗檢測 GP 的表達情況，同時收獲病毒上清，感染 293T 細胞，48 h 后測定細胞裂解液的熒光素酶活性。結(jié)果表明，EBOV-GP-Old 或EBOV-GP-New 都能夠正確表達，且表達水平接近（圖1B）。在感染細胞中，兩者均可顯著提高熒光素酶活性，遠高于對照組（圖1C）。這說明 GP 能與 pNL4-3 共轉(zhuǎn)后包裝成具有感染性的假病毒。

2.2產(chǎn)毒條件優(yōu)化

為了優(yōu)化 Zaire-EBOV GP/HIV-luc 的產(chǎn)毒條件，我們研究了不同劑量 GP 蛋白表達質(zhì)粒與病毒產(chǎn)量和感染性的關(guān)系，以確定 GP 包膜質(zhì)粒與核心質(zhì)粒間的最佳轉(zhuǎn)染比例。結(jié)果顯示，隨著 GP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的增加，細胞中 GP 蛋白的含量也隨之增加（圖2A）。當 EBOV-GP-Old 和 EBOV-GP-New轉(zhuǎn)染量分別為 0.2 和 0.1 μg 時，p24 含量最高（圖2B），這兩種劑量下測定的熒光素酶活性也較強，但相差不大（圖2C）。綜合分析病毒產(chǎn)量及其感染性兩因素后，我們統(tǒng)一將 GP 與 pNL4-3.Luc 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量比例定于 2∶3，用于后續(xù)實驗中。

2.3高通量篩選模型的建立

為了優(yōu)化高通量篩選模型中的各個條件，我們進一步研究病毒感染量及熒光測定時間點對最終熒光值的影響。將病毒液以不同比例稀釋并感染細胞，分別于 24、48 及 72 h 時檢測細胞熒光素酶活性。結(jié)果顯示，感染后 48 和 72 h 時熒光值較高，且隨著病毒稀釋比例的增加，熒光值逐漸降低（圖3）。根據(jù)以上結(jié)果，我們將病毒感染量及細胞熒光素酶活性測定時間分別設定為病毒稀釋比1∶5 和感染后 48 h。

為了評價該模型能否應用于高通量篩選，我們使用 Z′ 因子及 %CV 值評估該模型的質(zhì)量。Z′ 因子能夠同時反映信號的動態(tài)范圍和數(shù)據(jù)變化程度，是評價高通量篩選方法穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)。Z′因子大于 0.5 且 %CV 值小于 20% 時，則認為該模型符合高通量篩選標準，適用于高通量藥物篩選。表1 顯示，這兩種模型均符合高通量篩選的要求。

2.4陽性化合物對高通量篩選模型的檢測

粉防己堿是鈣離子通道阻斷劑，具有抗炎、免疫及抗過敏等作用，同時被證明其能夠抑制埃博拉病毒進入宿主細胞且在鼠體內(nèi)的抗埃博拉研究中取得了很好療效［8］。因此，我們以粉防己堿作為陽性化合物檢測該高通量篩選模型的靈敏性。結(jié)果顯示，不同濃度的粉防己堿與抗 EBOV-GP-Old/HIV-luc 和 EBOV-GP-New/HIV-luc 假病毒活性呈現(xiàn)較明顯的量效關(guān)系（圖4），IC50值分別為 938.7 nmol/L 和 56.13 nmol/L。

圖3　病毒稀釋比與檢測時間對熒光素酶活性的影響（A：EBOV-GP-Old/HIV-luc；B：EBOV-GP-New/HIV-luc）Figure 3　Effects of viral dilution and detection time on luciferase activities （A： EBOV-GP-Old/HIV-luc； B： EBOV-GP-New/ HIV-luc）

表1　評價高通量篩選方法的統(tǒng)計學參數(shù)值Table 1　Summary of statistical parameters to assess its accuracy of the HTS assay

圖4　粉防己堿的劑量效應關(guān)系（A：EBOV-GP-Old/HIV-luc；B：EBOV-GP-New/HIV-luc）Figure 4　Dose-response relationship of tetrandrine （A： EBOV-GP-Old/HIV-luc； B： EBOV-GP-New/HIV-luc）

圖5　樣品初步篩選結(jié)果（A：格爾德霉素及其衍生物；B：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物；C：天然產(chǎn)物單體化合物）Figure 5　Results of the preliminary screening （A： Geldanamycin and its derivatives；B： Macrolides fermentation broth and monomeric compounds； C： Monomeric compounds from natural products）

2.5樣品的初步篩選

有研究表明格爾德霉素抑制埃博拉病毒的復制［9］，大環(huán)內(nèi)酯類化合物具有廣譜抗病毒作用［10］。因此，我們利用 EBOV-GP-Old/HIV-luc 篩選模型對相關(guān)樣品進行了初步篩選，包括格爾德霉素及其衍生物 21 個、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物45個和天然產(chǎn)物單體化合物 176 個（圖5）。結(jié)果顯示，格爾德霉素及其衍生物中有20 個樣品對 EBOV 的抑制率高于 50%，陽性率達 95.23%。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物和天然產(chǎn)物單體化合物的陽性率分別為48.89% 和 5.68%。

2.6活性樣品的特異性分析

為了確認活性樣品對 EBOV-GP 的作用特異性，在排除對細胞毒性因素后，還同時檢測其對VSVG/HIV-luc 感染性的影響。VSVG/HIV-luc 與EBOV-GP/HIV-luc 有相同的 HIV 骨架，只是表面表達不同的病毒膜蛋白來介導病毒進入。若活性樣品只對 EBOV-GP 介導的病毒進入有明顯抑制作用，而對 VSV 病毒沒有抑制或抑制率很低，則說明此樣品對 EBOV 具有特異性。我們對初篩中獲得的活性樣品進行兩種包膜病毒抑制率的比較，并設依法韋倫為對照組。結(jié)果顯示，格爾德霉素及其衍生物、多數(shù)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物和天然產(chǎn)物同時對 VSVG/HIV-luc 與EBOV-GP/HIV-luc 發(fā)揮抑制作用。最終獲得 4 種對 EBOV 具有特異性抑制作用的樣品（圖6）。

3　討論

近年來，進入抑制劑已經(jīng)成為一類新的抗病毒藥物。EBOV-GP 蛋白介導 EBOV 與細胞表面受體的結(jié)合，通過病毒內(nèi)吞作用和膜融合進入宿主細胞。阻斷 EBOV-GP 介導的病毒進入將有效抑制病毒感染及由其引起的細胞毒性。因此，以 EBOV-GP為靶點進行抗埃博拉病毒藥物的篩選不失為一種較為理想的策略。

為了實現(xiàn)在低生物安全環(huán)境下篩選靶向EBOV-GP 蛋白的抗埃博拉活性樣品，本研究利用毒性最強的扎伊爾型 EBOV 的 GP 蛋白包裹 HIV核心制備復制缺陷型假病毒 EBOV-GP/HIV-luc，模仿 EBOV 的進入過程，并通過對病毒產(chǎn)量、感染比例及時間等因素進行優(yōu)化，建立高通量篩選模型。同時利用 Z′ 值及陽性化合物的量效關(guān)系驗證該模型的穩(wěn)定性和靈敏性。

1：DMSO；2：EFV（5 nmol/L）；3：C51#（15 μmol/L）；4：C126# （2.5 μg/ml）；5：C173#（5 μg/ml）；6：B6#（2.5 μmol/L）圖6　活性樣品的特異性分析Figure 6　Analysis for the specificity of samples

通過該高通量篩選模型初步獲得的活性樣品至少會有 4 種類別：①EBOV-GP/HIV-luc 的進入抑制劑；②HIV 復制抑制劑；③熒光素酶活性抑制劑；④細胞毒性樣品。因此，為了獲得能夠特異性抑制 EBOV 進入過程的活性樣品，還需要利用表達不同包膜蛋白的 VSVG/HIV-luc 對初篩結(jié)果進行特異性分析。值得說明的是，在應用該模型對多組樣品的初步篩選工作中，格爾德霉素及其衍生物具有較高陽性率且抑制率可達 90% 以上，但在與VSVG/HIV-luc 包膜病毒抑制率的比較后并未表現(xiàn)出對 EBOV 的特異性抑制作用。據(jù)研究報道，格爾德霉素以 Hsp90 為作用靶點發(fā)揮廣譜的抗病毒作用，可能是通過降解病毒的 RNA 聚合酶或影響感染性 EBOV 的出芽釋放過程［11］而對多種負鏈RNA 病毒發(fā)揮抗病毒作用的。本文的結(jié)果也表明格爾德霉素及其衍生物并不是通過阻斷 EBOV 的進入過程來實現(xiàn)自身對 EBOV 的抑制的，但是，格爾德霉素對 EBOV 的高抑制率也從另一方面證明了該組樣品做為抗 EBOV 藥物的可能性。

綜上所述，本文建立的抗 EBOV 進入藥物篩選模型，靶點明確，步驟簡單，穩(wěn)定靈敏，可應用于高通量篩選影響 EBOV 進入過程的活性樣品。抗 EBOV 進入藥物篩選模型的建立有助于推動特異性藥物機制研究，發(fā)現(xiàn)新的抗埃博拉病毒的有效藥物。

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Author Affiliation: Department of Immunobiology， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):193-199

Establishment and application of screening assay for EBOV entry inhibitor

WANG Jing， CHEN Shu-min， MA Ling， ZHANG Rui-xin， LI Zhuo-rong， YU Li-yan， CEN Shan

【Abstract】

ObjectiveTo establish a screening assay for EBOV entry inhibitors targeting EBOV glycoprotein and to screen samples with specific inhibition on the entry of EBOV by the models.

MethodsBy cell-based recombinant virus technology， the recombinant virus （EBOV-GP-Old/HIV-luc and EBOV-GP-New/ HIV-luc） were prepared by HIV core （pNL4-3.Luc） packed with two epidemic strains of EBOV glycoprotein， followed by further optimization of viral yield， infectivity， infection dose and determination time of luciferase activity. The stability and sensitivity of the assays were evaluated according to statistical parameters and positive compounds. 242 samples were screened and the vesicular stomatitis G packed pseudovirions （VSVG/HIV-luc） were used for analysis of sample specificity.

ResultsThe assay for EBOV entry inhibitors targeting GP protein was established. 4 samples were found to show the specific inhibition on the entry of EBOV using the HTS assay.

ConclusionThe assay is suitable for anti-EBOV drug screening and the obtained positive samples may lead toward the discovery of EBOV drugs.

【Key words】Ebolavirus；High-throughput screening assays；Entry inhibitor

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.001

基金項目：“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001-015）；國家自然科學基金青年基金（81501756）；國家微生物生物資源平臺（NIMR-2015-3）

通信作者：岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

收稿日期：2015-12-16

Corresponding Author:CEN Shan， Email： shancen@imb.pumc.edu.cn