人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)源性軟骨組織工程支架的制備及相關(guān)研究

劉舒云，侯克東，鹿亮，黃靖香，袁玫，許文靜，盧世璧，郭全義

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人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)源性軟骨組織工程支架的制備及相關(guān)研究

劉舒云，侯克東，鹿亮，黃靖香，袁玫，許文靜，盧世璧，郭全義

【摘要】

目的采用人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)為材料制備軟骨組織工程支架，并對其性能進行相關(guān)檢測。

方法人臍帶去除外膜及動、靜脈，通過機械粉碎、差速離心去細胞、冷凍干燥、紫外及化學(xué)交聯(lián)等方法將華通膠組織制備成三維多孔的軟骨組織工程支架，并通過組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)方法檢測其成分保留情況；將人骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合至支架，光鏡及電鏡下觀察細胞在支架上的生長狀況及基質(zhì)分泌情況，初步了解其生物相容性；將人臍帶去細胞華通膠支架植入兔背部皮下，通過組織化學(xué)及 CD4+/CD8+T淋巴細胞免疫熒光染色，了解其炎癥情況及免疫原性。

結(jié)果制備得到的人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)源性支架為三維多孔支架，保留了華通膠中糖胺多糖和 II 型膠原等成分，糖胺多糖含量為 7.05%，總膠原含量為 22.5%；接種于支架上的細胞黏附于支架孔壁上，生長狀態(tài)良好，并有基質(zhì)分泌；在體試驗未見明顯免疫反應(yīng)。

結(jié)論人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)的成分與軟骨細胞外基質(zhì)類似，有利于細胞黏附和生長，無明顯免疫原性，是一種較有前景的軟骨組織工程支架材料。

【關(guān)鍵詞】華通膠；細胞外基質(zhì)；組織工程；支架（骨科）

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):200-205

作者單位：100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科研究所北京市再生醫(yī)學(xué)重點實驗室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室

軟骨損傷難以自我修復(fù)，傳統(tǒng)治療方法無法達到滿意療效。組織工程是近年來興起的修復(fù)缺損組織的方法，為治療軟骨缺損帶來了新的希望。組織工程包含三方面要素，即支架、種子細胞和細胞因子。目前支架材料主要包括兩大類，即合成材料和天然材料，天然材料成分接近天然軟骨，細胞毒性小，生物相容性好。軟骨細胞外基質(zhì)來源的軟骨支架由于基質(zhì)成分及其比例與天然軟骨更為類似，因此成為近年來眾多研究者關(guān)注的熱點。但人源性軟骨細胞外基質(zhì)來源有限，成為限制其廣泛研究和應(yīng)用的因素。

臍帶是連接母體和胎兒的組織，包含兩條動脈和一條靜脈，周圍包繞著華通膠和臍帶外膜，胎兒分娩后即成為廢棄物。華通膠的生理功能是保護臍帶血管，防止其受外力擠壓，如子宮收縮、胎兒活動等引起的血管受壓，從而保障正常的臍帶血運［1-2］，該作用與關(guān)節(jié)軟骨緩沖受力、減少變形、損傷及摩擦的作用相似。另外，臍帶華通膠富含透明質(zhì)酸、硫酸化糖胺多糖及膠原等成分，與軟骨的細胞外基質(zhì)成分類似。此外，臍帶華通膠中無血管滋養(yǎng)管、神經(jīng)、淋巴等結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)特征也與軟骨類似［3-9］，同時因其屬于分娩廢棄物，不存在倫理問題，且來源豐富。基于上述特征，我們認為臍帶華通膠可能是一種較好的軟骨組織工程支架材料的來源。本研究采用去細胞、凍干及交聯(lián)的方法制備出去細胞人臍帶華通膠軟骨組織工程用支架，并對其成分、結(jié)構(gòu)、細胞毒性以及對細胞行為的影響、皮下免疫反應(yīng)等進行初步的研究。

1　材料和方法

1.1材料

正常足月妊娠新生兒臍帶由解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供；戊二醛、鋨酸、醋酸異戊酯、六甲基二硅胺烷（HMDS）、雙氧水、胰酶消化液、碳化二亞胺、甲苯胺藍、番紅花 O 染色所用試劑均為北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)；鼠抗人 II 型膠原抗體、鼠抗人 I 型膠原抗體及鼠抗人 Aggrecan 抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗抗體購自北京世安科興有限公司；DMEM 細胞培養(yǎng)基購自美國Sigma 公司；胎牛血清購自北京元亨金馬生物科技有限公司；小鼠抗兔 CD4 和 CD8 單克隆抗體購自美國 Research Diagnostics 公司；熒光素 TRITC標記抗小鼠 IgG 購自北京中山生物技術(shù)公司；新西蘭大白兔 6 只購自解放軍總醫(yī)院動物實驗中心，合格證號：SCXK（京 2007-0003），飼養(yǎng)于清潔普通環(huán)境中；羥脯氨酸測試盒購自南京建成科技有限公司；S-520 型掃描電子顯微鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1支架制備于無菌條件下剝離臍帶外膜及血管組織，余下的華通膠組織用無菌蒸餾水沖洗，3% 雙氧水浸泡 30 min，加入無菌三蒸水在低溫下反復(fù)粉碎成華通膠勻漿。向勻漿中加入 10 倍體積三蒸水混勻，-20 ℃ 冷凍后于常溫融化，反復(fù) 3 ～4 次凍融，使殘余細胞破碎。將勻漿經(jīng) 2000 r/min離心 20 min。取上清加入 1% Triton X-100、0.25%胰蛋白酶、Tris-HCl 緩沖液，于 4 ℃ 條件下輕輕攪拌，洗脫 24 h 后，3000 r/min 離心 20 min。上清用 DNase 和 RNase 混合液于 37 ℃ 消化過夜，4 ℃、6000 r/min 條件下離心15 ～ 20 min。充分洗去細胞碎片和殘留物質(zhì)，至 pH 7.0，取上層勻漿，10 000 r/min、4 ℃ 條件下離心 40 min，收集沉淀，即為去細胞的納米級臍帶華通膠漿料。

將收集到的人臍帶華通膠漿料調(diào)整為 3% （W/V）混懸液，充分攪拌均勻，注入聚乙烯圓筒模具中，-20 ℃ 預(yù)凍 30 min，放入冷凍干燥機中進行凍干，48 h 后形成三維多孔海綿支架。將支架置于 258 nm 波長紫外線照射下交聯(lián) 8 h，再于含 20 mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺和 50 mmol/L 乙基-二甲基胺-丙基碳化二亞胺的 95%（V/V）乙醇溶液中 4 ℃ 下交聯(lián) 24 h。無菌 PBS 漂洗浸泡 2 h，三蒸水漂洗去除殘余交聯(lián)劑，再次凍干，密封袋保存，60Co 照射消毒，4 ℃ 條件下保存?zhèn)溆茫?0-12］。

1.2.2細胞復(fù)合支架支架于培養(yǎng)液中浸泡 20 min后置于 6 孔板中，人 BMSCs以 1 × 107個/ml 的密度接種至支架上，37 ℃ 孵育 2 h，待細胞黏附于支架后，加入完全培養(yǎng)液 2 ～ 3 ml/孔。于 37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 2 ～ 3 d，以光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)及黏附情況。

1.2.3組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色將人臍帶組織冰凍切片（10 μm）及華通膠漿料涂片室溫晾干，分別用 95% 酒精固定 10 min，室溫晾干，進行 HE 和甲苯胺藍染色。免疫組化染色時，將固定、晾干的組織片于 3% 雙氧水中浸泡 10 min， 1 × PBS 緩沖液漂洗 3 次，5 min/次。免疫組化一抗（鼠抗人 II 型膠原、I 型膠原、Aggrecan 抗體）用 1 × PBS 緩沖液按 1∶200 比例稀釋，滴至蓋玻片上，4 ℃ 孵育過夜后，1 × PBS 緩沖液洗 3 次，5 min/次，室溫下二抗孵育 15 min，1 × PBS 緩沖液洗 3 次，5 min/次，DAB 顯色液室溫孵育 5 min，洗去多余顯色液，蘇木素染核 5 min，過鹽酸乙醇分化，水中浸泡 5 min，酒精系列脫水，二甲苯透明，樹脂封片后顯微鏡下觀察。

1.2.4糖胺多糖和總膠原含量檢測應(yīng)用二甲基亞甲藍（DMB）法，切取凍干華通膠細胞外基質(zhì)源性支架，稱重，加入含有木瓜蛋白酶的裂解液進行裂解，離心吸取上清，100 μl 裂解液加入 3 ml DMB顯色液，糖胺多糖中的硫酸軟骨素與二甲基亞甲藍帶正電染料結(jié)合，產(chǎn)生顏色，紫外分光光度計檢測。根據(jù)羥脯氨酸測試盒說明，進行顯色，紫外分光光度計測定羥脯氨酸含量，換算為總膠原蛋白含量（羥脯氨酸占膠原蛋白 13.4%）。

1.2.5電鏡觀察用鋒利刀片切取 10 mm2× 2 mm 大小樣品，1 × PBS 緩沖液清洗，依次進行2.5% 戊二醛及 1% 鋨酸固定，1 × PBS 緩沖液清洗樣品，酒精梯度脫水（50%、75%、90%、100%），醋酸戊酯置換 40 min，六甲基二硅胺烷干燥，表面噴鍍導(dǎo)電金屬，掃描電鏡觀察。

1.2.6體內(nèi)植入實驗取新西蘭大白兔 6 只，常規(guī)背部備皮、消毒，取正中切口長約 7 cm，依次切開皮膚、皮下組織。將大白兔隨機平均分為2 組：實驗組在兔背部深筋膜與肌膜之間埋植大小為 0.8 cm × 0.5 cm 的脫細胞華通膠支架；對照組同法皮下埋植兔脫細胞軟骨支架。每只兔背部均設(shè)3 個埋植點，各埋植點間距約 3 cm。皮膚切口均用 3-0 細絲線縫合，術(shù)后分組飼養(yǎng)。分別在埋植后1、2、4 周時取支架以及周圍組織行 HE 染色及CD4+/CD8+T 淋巴細胞免疫組織化學(xué)檢測，觀察炎癥反應(yīng)和細胞免疫情況［13］。

2　結(jié)果

2.1人臍帶華通膠成分檢測

組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色可見臍帶華通膠番紅花 O 染色、甲苯胺藍染色、II 型膠原、I 型膠原及 Aggrecan 免疫組化染色均呈陽性（圖1），表明人臍帶華通膠中富含糖胺多糖、II 型膠原、I 型膠原和軟骨蛋白聚糖等物質(zhì)，基質(zhì)成分與軟骨類似。

圖1　臍帶華通膠組織病理染色（A：足月健康人臍帶；B：番紅花 O 染色；C：甲苯胺藍染色；D：II 型膠原免疫組化染色；E：I 型膠原免疫組化染色；F：Aggrecan免疫組化染色）Figure 1　Histochemistry and immunochemistry staining of human umbilical cord Wharton’s jelly （A： Full-term healthy human umbilical cord； B： Safranine O staining； C： Toluidine blue staining； D： Type II collagen immunochemistry staining； E： Type I collagen immunochemistry staining； F： Aggrecan immunochemistry staining）

圖2　人臍帶華通膠及其細胞外基質(zhì)的觀察（A：剝?nèi)〉娜四殠A通膠大體觀察；B：去細胞漿料甲苯胺藍染色；C：去細胞漿料 II 型膠原免疫組化染色；D：去細胞漿料電鏡觀察）Figure 2　Observation of human umbilical cord Wharton’s jelly and its derived extracellular matrix （A： Macroview of the stripped-off human umbilical cord Wharton’s jelly； B： Toluidine blue staining of WJ-ECM； C： Type II collagen immunochemistry staining of WJ-ECM； D： SEM observation of WJ-ECM）

2.2去細胞華通膠支架的制備

所獲華通膠漿料經(jīng)電鏡觀察，顯示含大量膠原微絲及蛋白聚糖（圖2）。將漿料注入模具，通過冷凍干燥法成形，并進行物理及化學(xué)交聯(lián)，所得支架為白色、多孔結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀察可見支架內(nèi)部孔隙相互連通，孔徑大小較均一，直徑多分布于200 μm 左右（圖3）。

2.3糖胺多糖和總膠原含量檢測

通過 DMB 法檢測華通膠細胞外基質(zhì)源性支架的糖胺多糖含量為 7.05%，羥脯氨酸法檢測支架總膠原含量為 22.5%，表明該支架中保留了較多的糖胺多糖和膠原成分。

圖3　人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)源性支架的大體觀察（A）和電鏡觀察（B）Figure 3　Macroview （A） and SEM observation （B） of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold

圖4　人 BMSCs 接種于人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)源性支架 48 h 后的形態(tài)觀察（A、B：光鏡；C、D、E：電鏡）Figure 4　Observation of human BMSCs seeded in human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold after 48 h （A， B： Light microscope； C， D， E： SEM ）

圖5　人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)源性支架體內(nèi)免疫反應(yīng)（A ～ C：HE 染色；D ～ F： CD4+T 細胞免疫熒光染色；G ～ I：CD8+T細胞免疫熒光染色；紅色熒光為 CD4+/CD8+T 細胞，藍色熒光為 hoechst 33258 細胞核染色）Figure 5　Immunoreaction of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold in rabbit subcutaneous circumstance （A - C： HE staining； D - F： CD4+T cell immunofluorescence； G - I： CD8+T cell immunofluorescence； red fluorescence is CD4+/CD8+T cell； blue fluorescence is hoechst 33258 nucleus staining）

2.4細胞活性檢測

將人 BMSCs 以 1 × 107個/ml 的密度接種于華通膠細胞外基質(zhì)源性支架上，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 ～72 h，光鏡下觀察可見細胞貼附于支架內(nèi)部，電子顯微鏡下可見細胞生長狀態(tài)良好，并有基質(zhì)分泌（圖4）。

2.5細胞免疫反應(yīng)

術(shù)后 1 周去細胞華通膠支架無明顯炎癥細胞浸潤，CD4+和 CD8+單克隆抗體免疫熒光染色陰性；術(shù)后 2 周時，見有一定量的炎癥細胞浸潤，以中性白細胞為主，散在數(shù)個 CD4+T 淋巴細胞和CD8+T 淋巴細胞；術(shù)后 4 周時，去細胞華通膠支架有部分降解，且浸潤的炎癥細胞減少（圖5）；對照組兔脫細胞軟骨支架及周圍埋藏部位組織未見明顯淋巴細胞浸潤。結(jié)果表明，去細胞華通膠支架未誘發(fā)細胞免疫排斥，只有輕度的炎癥反應(yīng)。

3　討論

軟骨組織工程支架的制備材料主要包括合成高分子材料和天然材料兩大類。合成高分子材料主要有聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）及其共聚物（PLGA）等，它們雖然具有可控的強度、降解速度、微結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，但其降解產(chǎn)物均為酸性，不利于種植其上的軟骨細胞的生長和增殖，生物相容性不理想。另外，合成材料表面沒有天然材料所具有的特定的細胞識別信號，且親水性差，不利于軟骨細胞的黏附、增殖和基質(zhì)合成。天然材料主要有I 型膠原、殼聚糖、藻酸鹽、幾丁質(zhì)、纖維蛋白、透明質(zhì)酸，它們的優(yōu)點在于生物相容性好，且更易于細胞附著，但其與天然關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)成分仍存在較大差別，且缺乏軟骨細胞特定的細胞識別信號。軟骨細胞外基質(zhì)源性支架是近年來出現(xiàn)的軟骨支架研究新方向，它具備了天然軟骨細胞外基質(zhì)的成分和配比，能夠模擬天然的軟骨細胞微環(huán)境，利于軟骨細胞保持表型、細胞增殖和基質(zhì)合成，是一種富有前景的軟骨組織工程支架材料［2］。但目前軟骨細胞外基質(zhì)主要來源于尸體取材，材料來源存在較大限制，不利于其廣泛應(yīng)用。

臍帶華通膠細胞外基質(zhì)在成分組成及比例上與軟骨細胞外基質(zhì)類似，華通膠具有與軟骨相似的生理學(xué)功能［1-9］，缺乏血管和神經(jīng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點與軟骨類似，并且其來源廣泛，不存在倫理學(xué)問題，因此有望成為軟骨細胞外基質(zhì)的替代材料，用于軟骨組織工程支架的制備。本研究通過粉碎、去細胞、差速離心、凍干、交聯(lián)等方法制備得到人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)源性支架，掃描電鏡顯示支架內(nèi)部孔隙相互連通，孔徑范圍分布在 200 μm左右。組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示支架的糖胺多糖、II 型膠原染色均為陽性，定量結(jié)果也顯示經(jīng)去細胞等方法制備獲得的支架仍保留了華通膠細胞外基質(zhì)中的主要成分，并與軟骨細胞外基質(zhì)成分類似。光鏡及電鏡觀察顯示接種于支架內(nèi)的人 BMSCs貼附于支架孔隙內(nèi)壁，生長狀態(tài)良好，可分泌基質(zhì)。皮下植入實驗結(jié)果顯示，人臍帶華通膠細胞外基質(zhì)源性支架埋藏于兔背部皮下，未引起明顯免疫反應(yīng)。以上結(jié)果證明，臍帶華通膠細胞外基質(zhì)可用于制備軟骨組織工程支架，該支架具有與正常軟骨細胞外基質(zhì)類似的組成成分，能夠給接種的種子細胞提供良好的生長和分化的微環(huán)境，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的軟骨組織工程支架。

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Author Affiliation: Institute of Othopaedics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):200-205

·協(xié)會之窗·

Preparation and its related study of the engineering scaffold from human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived cartilage

LIU Shu-yun， HOU Ke-dong， LU Liang， HUANG Jing-xiang， YUAN Mei， XU Wen-jing， LU Shi-bi， GUO Quan-yi

【Abstract】

ObjectiveTo fabricate a novel scaffold of cartilage tissue engineering with human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix and assessed it’s function in vitro.

MethodsFull-term healthy human umbilical cords were collected in aseptic condition and the arteries and veins were removed. The remaining Wharton’s jelly was pulverized， centrifugated， lyophilized and cross-linked， and thus was fabricated into a three-dimensional porous scaffold for cartilage tissue engineering.

ResultsThe 3-D porous scaffold retained glycosaminoglycan and collagen content of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix， as the glycosaminoglycan content accounted for 7.05% and total collagen accounted for 22.5%. The human bone marrow-derived mesenchymal stem cells adhered to the scaffold， and growed well. The human umbilical Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold did not evoke immune rejection in the subcutaneous implantation of rabbit backs.

ConclusionThe human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix has very similar chemical component with cartilage extracellular matrix. It benefits for cell adherence and proliferation， and does not evoke immune rejection in vivo， so we propose it to be an ideal material for cartilage tissue engineering.

【Key words】Wharton’s jelly；Extracellular matrix；Tissue engineering；Scaffold

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.002

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863 計劃）（2012AA020502、2015AA020303）；國家自然科學(xué)基金重點項目（21134004）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81472092）

通信作者：郭全義，Email：doctorguo_301@163.com

收稿日期：2016-02-18

Corresponding Author:GUO Quan-yi， Email： doctorguo_301@163.com