玻璃化冷凍法保存兔腰椎間盤的實驗研究

胡成棟，劉曦，李盼，周玉軍，陳懷志，郭全義

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玻璃化冷凍法保存兔腰椎間盤的實驗研究

胡成棟，劉曦，李盼，周玉軍，陳懷志，郭全義

【摘要】

目的觀察玻璃化冷凍法保存兔腰椎間盤的效果。

方法選取 30 只新西蘭大耳白兔，隨機分為玻璃化冷凍組、常規低溫冷凍組和新鮮髓核細胞組，每組 10 只，將取下的腰椎間盤標本通過玻璃化冷凍法與常規低溫冷凍法分別凍存 30 d，復溫洗脫后，利用 MTT 比色法測量兩組腰椎間盤纖維環及髓核細胞的相對活性，利用臺盼藍拒染法檢測其細胞存活率。

結果MTT 比色法和臺盼藍拒染法所得結果基本一致，玻璃化冷凍組和常規低溫冷凍組兔腰椎間盤髓核細胞存活率和相對活性均低于新鮮髓核細胞組，玻璃化冷凍組的兔腰椎間盤髓核細胞存活率和相對活性均優于常規低溫冷凍組，其差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）。

結論玻璃化冷凍法保存兔腰椎間盤髓核細胞存活率及細胞活性高，保存效果優于常規低溫冷凍法。

【關鍵詞】玻璃化作用；低溫保存；椎間盤

作者單位：056001 河北省邯鄲市中心醫院骨二科（胡成棟、李盼、周玉軍、陳懷志），免疫科（劉曦）；100039 北京，中國人民解放軍總醫院骨科研究所（郭全義）

www.cmbp.net.cn中國醫藥生物技術, 2016, 11(3):247-251

目前臨床上經常用傳統低溫冷凍法保存腰椎間盤，但該法常導致細胞內外形成冰晶，由于凍融效應造成細胞損傷，腰椎間盤細胞存活率和活性下降，從而導致其應用受到限制［1］。玻璃化冷凍法采用高濃度溶液單步驟快速降溫，溶液轉變為玻璃樣無定形體，組織在保存過程中細胞內外不形成結晶，避免了細胞結構的破壞，有效保留了細胞的活性［2-4］。目前國內外已成功應用玻璃化法進行了多種細胞的保存（如卵母細胞、精子、成骨細胞、胚胎干細胞等），對組織玻璃化保存的研究也逐漸完善（如皮膚、胰腺、神經、血管、角膜、心臟瓣膜、腎臟、軟骨、肌腱等）。然而玻璃化法保存椎間盤的研究在國內外文獻中尚未見報道。作者在此基礎上，探索玻璃化法保存腰椎間盤的可行性，觀察保存效果并對玻璃化法保存兔腰椎間盤的實驗結果進行分析。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物4 ～ 5 個月齡新西蘭大白兔30 只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，清潔級，動物編號：1412033，雌雄各半，重量為 2.5 ～3.0 kg。實驗于 2013 年 4 月 - 2014 年 4 月在河北省邯鄲市中心醫院中心實驗室完成。

1.1.2儀器及試劑WKL 型微機程控降溫儀為北京歐科利技術發展有限公司產品；MDF-C2156VANX 型深低溫冰箱為日本 Sanyo 公司產品；D1008 型液氮保存罐為美國 Scilogex 公司產品；M-W-0081 型顯微手術器械為北京中興名業科技發展有限公司產品；BX51 型手術顯微鏡為日本 Olympus 公司產品。二甲基亞砜、乙酰胺、蔗糖均購自北京化學試劑有限公司；0.25% 胰蛋白酶、0.2% II 型膠原酶均購自德國 Serva 公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組隨機分為玻璃化冷凍組（實驗組），常規低溫冷凍組（對照組），新鮮髓核細胞組（空白對照組），每組 10 只。安樂死后無菌條件下切取兔腰 1 至骶 1 共 5 個椎間盤組織，去除纖維環及交界區組織，將分離出的髓核組織用于實驗。

1.2.2常規低溫冷凍組保存方法將腰椎間盤髓核組織樣本由常溫狀態浸入主要由 2.0 mmol/L 二甲基亞砜組成的 4 ℃ 冷凍液，利用微機程控降溫儀以 5 ℃/min 速率逐漸降溫至 -80 ℃，深低溫平衡 30 min，迅速投入液氮中保存。5、10、15、20、30 d 后分別將樣本取出，37 ℃ 水浴復溫（速率約100 ℃/min）30 s，用蔗糖 D-Hank′s 平衡液洗脫。

1.2.3玻璃化冷凍保存方法以二甲基亞砜和乙酰胺為基礎液，DMEM-F-12 細胞培養液為溶劑配制成二甲基亞砜和乙酰胺濃度均為 3.5 mmol/L 的玻璃化溶液，將樣本在 4 ℃ 經 3 個濃度梯度（25%、50%、75%）玻璃化溶液浸泡平衡處理，每濃度梯度平衡 15 min，轉入 100% 玻璃化溶液中平衡 30 min，然后迅速投入液氮中保存。5、10、15、20、30 d 后分別取出樣本，37 ℃ 水浴復溫（速率約 100 ℃/min）30 s 后，經 3 個濃度梯度（75%、50%、25%）的玻璃化溶液洗脫后再用蔗糖D-Hank′s 平衡液洗脫。

1.2.4細胞收集將兩種方法保存的腰椎間盤髓核樣本用 PBS 溶液涮洗 3 遍后移至盛有濃度為0.2% 的 II 型膠原酶中，剪碎為 1 mm3的組織塊，放入磁力轉子在 37 ℃，5% CO2的培養箱中消化 40 min。消化后的混懸液以 1700 r/min 離心5 min，棄上清液后加入 0.25% 胰蛋白酶，再次放入培養箱中消化 20 min，加入含 10% 血清的DMEM-F-12 培養液停止消化，離心棄上清液后將原代細胞以 3 × 104個/cm2密度接種于 96 孔培養板中。

1.3觀察指標

1.3.1MTT 比色法檢測細胞相對活性將原代細胞接種于 96 孔培養板后，將其置于 37 ℃，5% CO2培養箱內，48 h 后首次換液，之后隔天換液，當細胞生長到 80% ～ 90% 融合時，在培養板的各孔中加入 20 μl MTT 溶液（5 mg/ml），繼續培養4 h，加入 150 μl 二甲基亞砜，振蕩 10 min 以使晶體溶解充分。在酶聯免疫檢測儀上測定各孔在波長為 490 nm 處的吸光度值。

1.3.2臺盼藍法檢測細胞存活率取髓核原代細胞懸液 0.5 ml 加入 20 ml 試管中，加入 0.5 ml 0.4% 臺盼藍染液染色 2 ～ 3 min，吸取適量懸液涂于載玻片上，加上蓋玻片。利用血球計數板在倒置顯微鏡下計數藍染的死細胞及不染色的活細胞，計算髓核細胞存活率。計算公式為：回收率（%）=（洗脫后的細胞數/凍存前的細胞數）× 100%；存活率（%）=（洗脫后的細胞數/洗脫前的細胞數）× 100%。

1.4統計學處理

采用 SPSS17.0 軟件進行統計學分析和處理，計量資料采用±s 表示，組間差異采用 t 檢驗，以 P ＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1兔腰椎間盤組織取材后情況

兔腰椎間盤縱軸長為（1.2 ± 0.11）cm，橫軸長（0.5 ± 0.06）cm（圖1），椎間盤取材后需要立即用注射器抽取生理鹽水反復沖洗終板，以防止血液凝固后影響凍存試劑的滲透，影響凍存效果。

圖1　取材后的兔椎間盤組織Figure 1　The rabbit intervertebral disc after operation

2.2MTT 比色法檢測髓核細胞相對活性

實驗中用酶聯免疫檢測儀在 490 nm 波長處測定 96 孔板中各組的吸光值，可間接測量活細胞數量，玻璃化冷凍組和常規低溫冷凍組兔腰椎間盤髓核細胞相對活性均低于新鮮髓核細胞組，而玻璃化冷凍組髓核細胞相對活性高于常規低溫冷凍組，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05），隨著凍存時間的延長，常規低溫冷凍組髓核細胞相對活性逐漸下降，而玻璃化冷凍組髓核細胞活性基本不變（圖2）。

圖2　MTT 比色法檢測兩組兔腰椎間盤髓核細胞相對活性Figure 2　Relative activity of rabbit lumbar nucleus pulposus cells was tested by MTT assay

2.3臺盼藍拒染法檢測髓核細胞存活率

所有兔髓核細胞中，死細胞可被臺盼藍染成藍色，活細胞拒染。顯微鏡下計數藍染的死細胞及未著色的活細胞，統計分析后得出玻璃化冷凍組兔腰椎間盤髓核細胞存活率均低于新鮮髓核細胞組，而玻璃化冷凍組髓核細胞存活率高于常規低溫冷凍組，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05），隨著凍存時間延長，常規低溫冷凍組髓核細胞存活率逐漸下降，而玻璃化冷凍組髓核細胞存活率基本不變（圖3），臺盼藍拒染法和 MTT 比色法所測得結果基本一致。

圖3　臺盼藍拒染法檢測兔腰椎間盤髓核細胞存活率Figure 3　The viability of rabbit lumbar nucleus pulposus cells was tested by typan blue assay

3　討論

腰椎間盤位于兩個椎體之間，由周圍纖維環、中心髓核和上下軟骨終板三部分構成。目前臨床上腰椎間盤退變導致腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄、退變性腰椎滑脫、節段性腰椎不穩定等疾病逐漸增多，嚴重影響著人們的生活質量［5］。現在，治療嚴重椎間盤退行性病變常用的治療方法為椎體融合，但是椎體融合后限制相應節段脊柱的活動，使鄰近節段脊柱活動增加，從而加速了鄰近節段椎間盤退變［6］，人工椎間盤置換可保留相應節段脊柱的運動，但是其可使脊柱運動方式發生永久性改變，可導致相鄰節段椎體壓力增加以及不穩，同樣可加速鄰近節段椎間盤退變［7］，并且存在假體松動，下沉，磨損，自發融合等一系列問題［8］。隨著基礎醫學的發展，同種異體腰椎間盤移植成為治療腰椎間盤退變的一個理想方法，阮迪克等研究同種異體椎間盤移植系列動物試驗及臨床手術，初步應用均取得了滿意效果，并對多名椎間盤移植治療的患者進行 5 年隨訪，隨訪結果也非常滿意［9-10］。然而，由于同種異體椎間盤的供體少、保存時間、尺寸匹配、傳染性疾病等原因嚴重限制了其在臨床上的推廣與應用。因此，研究椎間盤的長期保存方法，將有助于建立椎間盤組織庫，進而可促進同種異體椎間盤移植治療方法在臨床上的開展。目前，保存椎間盤常采用慢速冷凍法，該法易使椎間盤細胞內外形成冰晶，導致細胞脂質膜及細胞結構損傷，復溫后椎間盤細胞存活率和活性下降，且其操作復雜繁瑣，導致其在椎間盤移植中的應用受到限制。本實驗旨在探討玻璃化冷凍保存腰椎間盤的可行性，并分析其保存效果，為椎間盤移植技術的應用提供理想的組織保存方法。玻璃化保存方法已成功用于胚胎、肌腱、胰島、組織工程骨、關節軟骨等多種組織的保存，并取得了理想的效果，但采用此方法保存腰椎間盤尚未見報道。

玻璃化法指采用高濃度溶液單步驟快速降溫，使物質由液態轉變為介于液態和固態之間的非結晶高黏稠狀態（玻璃樣無定形體），冷凍過程無相變，物質連續固化形成玻璃態，細胞內外不形成結晶或僅少量結晶，玻璃態物質的分子間關系與液態相比無明顯改變，無細胞結構破壞，細胞活性得到了較好保存［4， 11-12］。玻璃化溶液常由滲透性低溫保護劑、小分子糖類、高分子聚合物 3 種成分組成。常用的滲透性低溫保護劑為二甲基亞砜。高分子聚合物包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖、葡聚糖等，可通過降低細胞外所需的滲透性低溫保護劑的濃度來減輕對細胞的毒性［13］。小分子糖類如葡萄糖、蔗糖等，無細胞毒性，但有較強的滲透效應，可以使細胞脫水，從而降低細胞內滲透性低溫保護劑的濃度，減輕細胞腫脹［14］。玻璃化法比傳統的低溫冷凍法所用的冷凍保護劑濃度大很多，冷凍保護劑的濃度越高，毒性也就越大。本試驗對冷凍保護劑進行了合理配置，兼顧強穿透性和強玻璃化能力，又降低了保護劑的毒性，使其玻璃化效果達到了最好。我們選擇了低毒性的冷凍保護劑二甲基亞砜，并且在玻璃化冷凍開始之前應用四步平衡法從低濃度向高濃度建立滲透梯度，使冷凍保護劑均勻緩慢地滲入細胞，嚴格控制每個步驟的平衡時間，使細胞內的溶液濃度達到玻璃化的要求。復溫后采用蔗糖 D-Hank′s 平衡液代替等滲溶液對椎間盤髓核組織進行洗脫，這樣既可防止水分子快速滲入細胞導致細胞崩解，又可加速冷凍保護劑從細胞內排出，減輕保護劑對細胞的毒性損傷。

MTT 比色法和臺盼藍拒染法檢測髓核細胞相對活性和細胞存活率，玻璃化冷凍組和常規低溫冷凍組兔腰椎間盤髓核細胞相對活性和細胞存活率均低于新鮮髓核細胞組，而玻璃化冷凍組髓核細胞相對活性和細胞存活率高于常規低溫冷凍組，隨著凍存時間的延長，常規低溫冷凍組髓核細胞相對活性和細胞存活率逐漸下降，而玻璃化冷凍組基本不變。由此我們可以得知，玻璃化法凍存兔椎間盤組織過程中細胞存活率和相對活性不隨凍存時間延長而下降，凍存效果優于常規低溫冷凍法，凍存效果比較理想，可用于長期保存組織、細胞或器官，但是移植效果需進一步體內實驗驗證。尋找對兔腰椎間盤組織和細胞毒性較小的玻璃化溶液配比方案和優化腰椎間盤玻璃化低溫保存程序，并觀察玻璃化保存后的移植效果是本研究下一步的重點。

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ObjectivesTo observe the effect of preservation of the rabbit intervertebral disc by vitrification.

MethodsThirty New Zealand white rabbits were randomly divided into vitrification preservation group， cryopreservation group and fresh nucleus pulposus cells group， with ten rabbits in each group. The specimens of the lumbar intervertebral disc were frozen by vitrification or cryopreservation respectively for 30 d. Then， the complex was removed from storage and rapidly thawed in a 37 ℃shaking water bath. MTT colorimetric method was used to measure the relative activity of two groups of lumbar intervertebral disc annulus and nucleus pulposus cells， and cell survival rate was detected by using the method of the trypan blue dye exclusion assay.

ResultsThe final results of MTT colorimetric method were basically in agreement with the results of trypan blue dye exclusion assay. The survival rate and relative activity of the rabbit lumbar disc nucleus pulposus cells in the vitrification preservation group and cryopreservation group were less than those in the fresh nucleus pulposus cells group. The survival rate and relative activity of the rabbit lumbar disc nucleus pulposus cells in the vitrification preservation group were better than those in the cryopreservation group， and the difference was statistically significant （P ＜ 0.05）.

ConclusionThe intervertebral disc preserved by vitrification had higher survival rate and better activity than the cryopreservation group.

【Key words】 Vitrification；Cryopreservation；Intervertebral disc

Author Affiliations: The Second Department of Orthopedics （HU Cheng-dong， LI Pan， ZHOU Yu-jun， CHEN Huai-zhi），Department of Rheumatology （LIU Xi）， Handan Central Hospital， Hebei 056001， China； Institute of Orthopedics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100039， China （GUO Quan-yi）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):247-251

An experimental study on the vitrification preservation of rabbit intervertebral disc

HU Cheng-dong， LIU Xi， LI Pan， ZHOU Yu-jun， CHEN Huai-zhi， GUO Quan-yi

【Abstract】

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.009

基金項目：河北省邯鄲市科學技術研究與發展計劃項目（0928108052）

通信作者：胡成棟，Email：hcd111111@163.com

收稿日期：2015-12-18

Corresponding Author:HU Cheng-dong， Email： hcd111111@163.com