兒童專科醫院特色生物樣本庫的建立與應用

王敏，高志梅，呂志寶，陳方，周君梅

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兒童?？漆t院特色生物樣本庫的建立與應用

王敏，高志梅，呂志寶，陳方，周君梅

作者單位：200040 上海交通大學附屬兒童醫院中心實驗室（王敏）；200040 上海市兒童醫院中心實驗室（高志梅、呂志寶、陳方、周君梅）

生物樣本庫是一種集中收集、處理、存儲和應用各種生物材料及其相關信息用于疾病的臨床診療研究的生物應用系統［1］。一般由兩部分組成：一是樣本實體庫，即可以從中提取到 DNA、RNA、蛋白質等成分的組織或血液等生物樣本；二是樣本信息庫，包括從生物樣本中提取 DNA、RNA、蛋白質等成分所得到的個人獨有的遺傳信息數據及臨床診療信息［2］。

早在 1994 年，中國科學院就建立了中華民族永生細胞庫［3］，隨著轉化醫學受到越來越多的重視，國內生物樣本庫建設也漸趨升溫［4-5］。2003 年，我國啟動了“國家自然科技資源共享平臺建設”項目，科學技術部在《“十二五”生物技術發展規劃》中明確指出，要“建設若干資源共享的重大科技基礎設施”，包括“大型生物樣本、標本、病例資源和人類遺傳資源庫以及共享服務體系”［6］。

上海市兒童醫院擁有豐富的兒童疾病資源，在上海交通大學醫學院“985 工程”三期樣本庫項目和上海市科委樣本庫重大項目的資助下，為了整合各臨床科室分散收集和存儲的疾病樣本，于 2012 年初開始籌建面對全院臨床科室的兒科疾病的生物樣本庫，同時開始培養專職工作人員，建立全院統一的標準化管理制度和技術規范［7］，目的在于科學采集、處理和存儲兒科疾病樣本資源，為相關疾病的基礎和臨床研究提供材料。以兒童腫瘤、出生缺陷和遺傳代謝性疾病為特色的兒童?？漆t院生物樣本庫已初步建成，標準化、規范化的樣本采集、存儲和管理體系也已經建立。

1　系統和流程

1.1軟件系統

1.1.1規章制度與專職團隊我院生物樣本庫在參考國際及國內其他生物樣本庫相關標準制度的前提下，結合本院自身特點，在學術委員會和倫理委員會的指導下，成立了樣本庫管理中心（圖1），制定了一系列管理制度，包括樣本庫標準操作規程、人員培訓管理、臨床溝通管理等。樣本庫的標準操作規程嚴格規定了從樣本庫的規劃建設到樣本出入庫過程的每一個環節，使之有章可循、有據可考。人員培訓管理和臨床溝通管理旨在貫徹落實樣本庫專人負責，專職人員定期接受針對性的專業培訓，提升其對樣本庫的管理能力。

圖1　我院生物樣本庫管理框架及工作流程

1.1.2信息系統樣本的信息包括樣本本身所含遺傳信息及其所對應的捐獻者的相關臨床診療信息。我院生物樣本庫應用上海交通大學醫學院統一的生物樣本庫信息管理系統，對出入庫的樣本進行信息化管理，實現在庫樣本的實時統計與查詢和樣本信息的實時自動化備份；同時，我院樣本庫信息系統與我院的臨床數據庫初步對接，進一步促進樣本臨床信息管理的規范化、網絡化，其目的是使信息的查詢更加快速便捷、提高生物樣本庫的使用效率；在數據安全性方面，該信息系統能夠定義使用權限設置與系統登錄自動化記錄，保證生物樣本信息的安全及隱私［8］。

1.2硬件系統

我院生物樣本庫設有專屬場地，冰箱、空調均配備雙電路系統并獨立配電，保證用電設備的正常運行、環境溫度的可控。按照功能，生物樣本庫分為樣本接收區、樣本處理和質控區、樣本存儲區和信息管理區等區域（圖2）。

選擇第三方認證的綠色債券逐漸增多，第三方認證機構中安永業務排名領先。從認證只數看，第三方認證的債券只數同比上漲89.18%，安永認證只數位列第一，2017年新加入的第三方認證機構包括畢馬威、普華永道、中誠信等；從認證金額看，安永依然位列第一。綠色企業債由發改委審核，不要求進行第三方認證，故剔除綠色企業債后，第三方認證債券數量占比達到85.2%，認證金額占比達到81.52%。總體來看，第三方認證的綠色債券數量穩中有升，綠色債券市場越發規范，市場透明度逐步提高。

1.2.1樣本接收區該區域用于放置樣本交接所需的各類文件材料，包括含有樣本基本信息及采集者、接收者簽字的樣本登記表，臨床標本運送信息卡以及患兒家屬簽字的知情同意書等。

1.2.2樣本處理和質控區該區域配備有 DNA 自動化抽提儀、低溫高速離心機用于樣本的處理和分裝；條碼打印機配備相應冷凍條碼標簽于樣本入庫前打印以清晰標記每份樣本；激光條碼掃描槍用于樣本入庫時掃描凍存管上粘貼的二維碼以確保樣本位置的準確性。另有質量控制相關設備，包括紅外/紫外分光光度計用于核酸濃度及純度的測定，多功能酶標儀測定蛋白濃度，實時熒光定量 PCR 系統檢測基因表達，以及可進行各類凝膠電泳的通用電泳儀和化學發光成像系統。

1.2.3樣本存儲區該區域配備有 4 ℃ 冰箱、-20 ℃ 冰箱、-80 ℃ 超低溫冰箱、-150 ℃ 臥式超低溫冰箱以及液氮存儲罐，可滿足不同類型的樣本在不同溫度下的存儲要求。冰箱內部空間合理規劃，根據疾病和樣本類型為各臨床科室預留樣本存儲空間，并在樣本信息管理系統中的樣本存儲設置中同步規劃。樣本接收登記后，按照信息系統中所提供的位置有序擺放。樣本存儲室及冰箱配備冷鏈溫度監控系統，可實時監測樣本存儲室及冰箱的溫度，且該系統與樣本庫管理人員通訊設備連接，可將室內及冰箱內部溫度變化發送給管理人員，實現遠程實時監控，幫助管理人員對突發事故做出及時應對。

1.2.4信息管理區該區域配備生物樣本庫信息管理系統服務器及專用計算機、冷鏈溫度監控系統專用計算機，保證各設備的正常運行，并可在該區進行樣本的出入庫管理、查詢等操作。樣本庫的各項文件資料包括管理制度和操作流程等也保存于該區域。

1.2.5庫房除了以上功能區域，樣本庫還設有專用庫房，用于存放樣本處理過程中所用到的各種實驗耗材，包括凍存盒、血液凍存管、組織液氮凍存管等；以及各種試劑，包括用于保護組織中 RNA 穩定性的 RNA later、DNA 自動化抽提儀配套試劑盒等。

1.3樣本出入庫流程

1.3.1樣本采集前的準備樣本采集方案經倫理委員會審查批準后實施。樣本采集前由臨床醫師與患兒家屬溝通，解釋說明樣本采集的意義、方法以及對樣本捐贈者可能造成的影響，與患兒家屬簽訂知情同意書。另外我院特別制定了“一病一卡”管理制度［7］，保證樣本采集和運輸的科學性、規范性，從源頭上保證樣本質量。

1.3.2樣本采集倫理委員會審查批準并獲得患兒家屬知情同意書后，由臨床工作人員嚴格按照相關采集流程合理規范采集所需樣本，于容器表面注明樣本基本信息，填寫樣本登記表、臨床標本運送信息卡以及知情同意書等材料。

1.3.3樣本接收與入庫臨床工作人員將樣本及相關材料與樣本庫管理人員交接后由后者對樣本進行處理并入庫。為避免樣本使用時反復凍融影響樣本質量，收到的樣本被分裝成小份凍存，凍存管外粘貼帶有唯一二維碼的條碼標簽，放入凍存盒后按照信息系統生成的冰箱位置進行存儲；存儲過程中，由樣本庫兩名工作人員共同進行樣本信息及存儲位置信息的核對和確認，保證信息的正確導入。

圖2　生物樣本庫布局示意圖

1.3.5樣本出庫使用者需遞交申請單，經學術委員會和倫理委員會審核批準后方可由樣本庫管理人員從信息系統中查詢所需樣本位置然后將其正確取出；樣本出庫過程由樣本庫兩名工作人員共同現場核對與確認，并在樣本出庫后，于信息管理系統中完成出庫登記及庫存的及時更新。

2　取得的成績

自 2012 年年初至今，在上海交通大學醫學院“985 工程”三期樣本庫項目和上海市科委樣本庫重大項目的資助下，我院建立了樣本庫管理體系，培養了專職的樣本庫管理團隊，完善配備了專業的樣本庫場地與設備，通過整合與新建并舉，原先各臨床科室分散存儲的樣本得到了統一規范管理，同時與各臨床科室聯合收集了多個病種的疾病樣本，已初步建成了以兒童腫瘤、出生缺陷和遺傳代謝性疾病為特色的兒童?？漆t院生物樣本庫，并已開始支持科研課題的立項和開展。

樣本庫所在場地合理規劃布局，硬件設施配備齊全，樣本接收、處理、存儲、質控和信息等各個功能區域獨立劃分、功能明確；信息系統已較為完善，可為各臨床科室提供便捷的樣本管理，通過權限設置保證了信息的安全性；管理人員嚴格按照所制定的各項規章制度規范化操作，已基本形成了標準化、規范化的樣本采集、存儲和管理體系。

2.1入庫樣本穩步增長，質量達標

在軟硬件設施完善的基礎上，目前樣本庫收錄了多個臨床科室的以兒童腫瘤、遺傳代謝和出生缺陷為特色病種的疾病樣本。自樣本庫建設之初至 2013 年第一季度僅收集了6 個病種的不足 300 份樣本；至 2014 年初，樣本庫飛速發展，入庫病種數超過 20 種、樣本量突破 10 000 份；至今，入庫病種數已基本穩定，入庫樣本量保持持續穩步上升的狀態，現已庫存 25 個病種 20 000 余份樣本（圖3）。

圖3　生物樣本庫庫存樣本總數及病種數統計

圖4　瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 完整性（M：分子量標準；1 ～ 10：外周血中抽提的 DNA）

在保證入庫病種和樣本數量的基礎上，樣本庫對入庫樣本開展質控檢測，抽提的核酸純度較高，A260/A280、A260/A230 均在 1.8 以上，凝膠電泳 DNA 條帶完整（圖4），RNA28S/18S 條帶比值在 1.3 ～ 1.8 之間，核酸完整性好，無明顯降解，且后續 PCR 擴增能力正常；Western blot 條帶顯示蛋白未發生降解。

2.2入庫樣本支持的科研成效

首先，生物樣本庫支持了各級別科研課題的立項，分別來自國家自然科學基金、上海市科委、上海市教委、上海市衛生計生委、上海交通大學醫學院等。以國家自然科學基金為例，近 3 年生物樣本庫共支持了 15 項國家自然科學基金項目的立項，約占同時期本單位國家自然科學基金立項總數的 75%。涉及的病種包括遺傳性腎炎、隱睪、自閉癥、先天性髖關節脫位、先天性巨結腸、先天性膽道閉鎖、神經母細胞瘤、川崎病、性發育不良等。這些課題將針對特定疾病的臨床早期預警及相關基因突變、早期診斷的生物學標記物、個體化治療等開展研究。在此基礎上，本樣本庫已被納入上海市重大疾病臨床生物樣本實體庫專業技術服務平臺。

其次，利用生物樣本庫的樣本開展的研究已經發表多篇論著，其內容涉及樣本庫的規范管理［7， 9］，以及先天性巨結腸［10］、神經母細胞瘤［11-12］等疾病相關的臨床研究。

3　小結

作為一家三級甲等兒童專科醫院，上海市兒童醫院擁有豐富的兒科臨床疾病資源，這些寶貴的資源若能得到合理采集和存儲，繼而用于轉化醫學研究，將為兒科疾病的診療帶來新方法。經過多方調研和學習，我院于 2012 年初開始籌建面向全院臨床科室的兒科疾病生物樣本庫，同時參照國內外樣本庫建設標準，結合自身特色，建立了較為完善的樣本庫標準化管理制度和技術規范，在之后的實際運行中不斷發現并解決問題、改進和完善工作流程，目前已取得良好的成果。以兒童腫瘤、出生缺陷和遺傳代謝性疾病為特色的生物樣本庫已基本建成，可為相關疾病的基礎和臨床研究提供疾病樣本。樣本庫支持的各級科研課題的立項和論著的發表，也標志著我院樣本庫從建設階段向產出階段的轉換。

樣本庫建立之初，由于經驗不足，相關制度不完善，遇到各種問題，主要涉及樣本的規范化采集和運輸、與臨床醫師的溝通、樣本的質量控制等方面。經過專職管理人員的努力，遇到的問題都得到了較好的解決，這些經驗教訓可供初建樣本庫的醫院借鑒。

3.1樣本采集過程遇到的問題與解決方法

我院生物樣本庫建立之初工作進展緩慢，入庫的疾病病種及樣本數量未有明顯增長?？紤]有以下原因：①生物樣本庫作為本院一項新開展的工作還不被大多數工作繁忙的臨床醫師所了解和理解，對加入其中尚有顧慮；②各科室各病種原有的樣本采集及運輸等流程不統一，操作復雜，一方面導致樣本庫人員工作量加大，難以負荷更多的樣本量，另一方面臨床醫師對樣本的標準化采集不了解，尤其是對基于尚未立項的疾病樣本的采集缺乏戰略眼光和全面布局，雙方的因素同時限制了樣本庫工作面向全院的推廣。

從保證樣本質量的目的出發，針對以上問題，我院樣本庫工作人員通過組織培訓、與臨床醫師交流溝通等方式，在全院范圍內大力宣傳生物樣本庫建設的深遠意義，并積極與臨床醫師合作，根據每個病種的特點和科研需求研究制定了該病種對應的《臨床運送標本信息卡》［7］。此卡片涵蓋了每個病種需要采集的樣本類型、數量、采集方式及與之匹配的運輸條件、保存方式等，臨床醫師只需填寫患者基本信息（姓名、住院號），然后按照實際采集的樣本對以上各項進行勾選即可，即“一病一卡”，操作簡捷。此項制度具有以下優點：①保證了生物樣本采集和運輸過程的規范化和標準化，保證了該病種未來研究所需的樣本的種類和數量均能滿足需求，從源頭上保證了樣本質量；②保證了樣本采集和運輸過程的科學性和條理性，提高工作效率；③大大減少了臨床醫師的工作量，有助于調動其采集樣本的積極性；④信息卡片上的患者信息為將來樣本信息與臨床資料信息的聯網、整合樣本實體庫和臨床資料庫提供了充足的條件。自“一病一卡”制度應用以來，樣本庫的入庫病種數快速增加，逐漸穩定后，入庫的樣本數仍維持著穩定的增長態勢。

3.2樣本質量的保證

樣本質量是整個樣本庫的核心［13］，高質量的樣本對于深入研究疾病以完善診療非常關鍵［14］，而科學研究所得到的數據是否可靠則有賴于樣本在采集、處理及存儲等各階段嚴格的質量控制［15］。因此，我們在保證樣本質量方面做了大量工作：①從樣本采集的源頭進行質量控制：分析前變量的控制是實現實驗結果一致性及可重復性的重要因素之一［16］，我院生物樣本庫通過“臨床運送標本信息卡”制度的實施，實現了樣本的采集過程、采集形式、信息留取、目標形式等方面的規范，從源頭上保證了樣本的質量；②樣本處理及存儲中的質量控制：為了保證所有生物樣本庫相關課題都能得到有意義的結果，我院生物樣本庫參考了國內外相關標準制度并結合本院自身特點，制訂了嚴格可行的操作流程以及完善的質量控制體系，核酸的抽提和質控由專人負責、保證了樣本處理規范，同時，專職人員定期接受樣本庫相關培訓，提高樣本庫管理能力。通過定期隨機抽檢在庫樣本，實現了對在庫樣本質量變化的監測，冷鏈溫度監控系統、標準的存儲空間及設施等保證了樣本存儲環境的正常狀態。

3.3生物樣本的利用

利用生物樣本進行生命科學研究、進而服務于臨床診療是生物樣本庫建設的最終目的［17-18］，只存儲而不利用生物樣本是對社會資源的浪費。我院生物樣本庫在近 3 年多的建設和運行過程中，采集和存儲的樣本以兒童腫瘤、出生缺陷和遺傳代謝性疾病為特色，迄今已經支持了涉及多病種的多項國家和省市級課題的立項，其研究結果已經開始支持相關論著的發表，標志著我院的生物樣本庫已經從建設階段轉換到產出階段，未來必將服務于更多的科研課題，同時吸引更多合作者利用我院生物樣本庫進行轉化醫學研究、增加產出，使其存在更有價值。

我院生物樣本庫在取得現有成績的基礎上正努力完善，現有的樣本信息系統只是實現了與臨床資料的初步對接，未來的工作重點是將樣本信息系統與患者的臨床信息、隨訪信息等深度整合、提升整合后系統的訪問效率［19］，使我院生物樣本庫真正成為樣本收集完備、臨床資料齊全、隨訪資料完整的精品生物樣本庫，更加全面、便利地為多學科的科研及各項人才計劃等項目提供寶貴資源，提升生物樣本庫對醫院學科和人才的支撐作用。

參考文獻

［1］ Artene SA， Ciurea ME， Purcaru SO， et al. Biobanking in a constantly developing medical world. ScientificWorldJournal， 2013， 2013：343275.

［2］ Wagstaff A. International biobanking regulations： the promise and the pitfalls. Cancer World， 2011， 42：23-29.

［3］ Chu JY， Xu JJ， Fu SB， et al. The establishment of the immortalize cell bank of different Chinese ethnic groups. Int J Genet， 2008， 31（4）：241-247. （in Chinese）褚嘉祐， 徐玖瑾， 傅松濱， 等. 中華民族永生細胞庫的建立. 國際遺傳學雜志， 2008， 31（4）：241-247.

［4］ Marincola FM. Translational medicine： a two-way road. J Transl Med，2003， 1（1）：1.

［5］ Li X， Du X， Ma CS. Resource sharing of biobank through public database. Translational Med J， 2014， 3（6）：327-329. （in Chinese）李新， 杜昕， 馬長生. 從生物樣本庫到開放數據庫. 轉化醫學雜志，2014， 3（6）：327-329.

［6］ Xu BB， Wang CY， Chen L， et al. Thoughts on the construction of China national bio-bank. Chin Hosp， 2014， 18（11）：31-32. （in Chinese）徐貝貝， 王彩云， 陳璐， 等. 國家級生物樣本庫的建設思考. 中國醫院， 2014， 18（11）：31-32.

［7］ Wu J， Gu YJ， Zhou JM. The establishment and application of “one disease one card” in biobank management. Chin J Hosp Adm， 2013，29（11）：866-867. （in Chinese）吳靜， 顧怡珺， 周君梅. 我院生物樣本庫“一病一卡”管理制度的建立與應用. 中華醫院管理雜志， 2013， 29（11）：866-867.

［8］ Lang T， Zhou CZ， Xu XY. Information risk assessment of the biobank Based on the ISO27001 system. Chin Med Biotechnol， 2014，9（3）：228-230. （in Chinese）郎濤， 周崇治， 徐曉寅. 基于ISO27001體系的生物樣本庫信息風險評價. 中國醫藥生物技術， 2014， 9（3）：228-230.

［9］ Gao Z， Gu Y， Lv Z， et al. Practical electronic information system and printed recording promote management accuracy in an early-stage small-scale non-automatic biobank. Biopreserv Biobank， 2015， 13（1）：61-66.

［10］ Xu LC， Zhou JM， Li H， et al. Distribution of mast cells and its role in different phenotypes of Hirschsprung's disease. Chin J Pediatr Surg，2014， 35（7）：495-499. （in Chinese）許靈蒼， 周君梅， 李會， 等. 肥大細胞在先天性巨結腸各表型中的分布及其作用. 中華小兒外科雜志， 2014， 35（7）：495-499.

［11］ Wu W， Shao JB， Zhou JM， et al. The unduced effect of arsenic trioxide in different types of neuroblastoma cell lines. Chin J Appl Clin Pediatr，2015， 30（15）：1164-1167. （in Chinese）吳偉， 邵靜波， 周君梅， 等. 三氧化二砷對3種神經母細胞瘤細胞株的誘導作用. 中華實用兒科臨床雜志， 2015， 30（15）：1164-1167.

［12］ Shao JB， Wu W， Li LL， et al. Study on 13-cis retinoic acid inducing differentiation of three types of human neuroblastoma cell lines in vitro. Chin J Appl Clin Pediatr， 2015， 30（15）：1152-1156. （in Chinese）邵靜波， 吳偉， 李玲玲， 等. 13-順式維甲酸體外誘導3種神經母細胞瘤細胞株分化研究. 中華實用兒科臨床雜志， 2015， 30（15）：1152-1156.

［13］ Hu Y， Zhang LH， Song LJ， et al. The factors and evaluation of the impact of biological sample quality. Chin Med Biotechnol， 2013，8（1）：69-72. （in Chinese）胡穎， 張連海， 宋麗潔， 等. 生物樣本質量的影響因素與評估. 中國醫藥生物技術， 2013， 8（1）：69-72.

［14］ Dowst H， Pew B， Watkins C， et al. Acquire： an open-source comprehensive cancer biobanking system. Bioinformatics， 2015，31（10）：1655-1662.

［15］ Compton C. Data quality and personalized medicine -- the collection，processing and banking of biospecimens. Oncol Exchange， 2014，13（1）：13-15.

［16］ Kang HJ， Jeon SY， Park JS， et al. Identification of clinical biomarkers for pre-analytical quality control of blood samples. Biopreserv Biobank， 2013， 11（2）：94-100.

［17］ Polasek O. Future of biobanks-bigger， longer， and more dimensional. Croat Med J， 2013， 54（5）：496-500.

［18］ Zhang YH， Yan YJ， Fang H， et al. Establishment of biobank of chronic diseases in Minhang District. Chin Med Biotechnol， 2013， 8（4）：308-310. （in Chinese）張穎華， 嚴玉潔， 方紅， 等. 閔行區慢性病生物樣本庫的建立. 中國醫藥生物技術， 2013， 8（4）：308-310.

［19］ Bowton E， Field JR， Wang S， et al. Biobanks and electronic medical records： enabling cost-effective research. Sci Transl Med， 2014，6（234）： 234cm3.

·講座·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.017

基金項目：上海市衛生計生委重點科研課題（201540389）；上海市重大疾病臨床生物樣本實體庫專業技術服務平臺（15DZ2292100）；上海交通大學醫學院“985 工程”三期樣本庫項目（YBKL2013008）

通信作者：周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

收稿日期：2016-01-28