先天性膽總管囊腫膽總管上皮緊密連接蛋白表達(dá)及其意義

王興東，汪 健，郭萬(wàn)亮，盛 茂

(蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 a.病理科，b.普外科，c.影像科，江蘇 蘇州 215003)

先天性膽總管囊腫膽總管上皮緊密連接蛋白表達(dá)及其意義

王興東a，汪 健b，郭萬(wàn)亮c，盛 茂c

(蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 a.病理科，b.普外科，c.影像科，江蘇 蘇州 215003)

目的 了解先天性膽總管囊腫(congenital choledochal cyst，CCC)膽總管上皮緊密連接蛋白表達(dá)是否有改變。方法 收集12例兒童CCC膽總管標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)并結(jié)合圖像分析系統(tǒng)，分析兒童CCC膽總管上皮緊密連接相關(guān)蛋白水閘蛋白(occludin)、水閘蛋白-1(claudin-1)表達(dá)的改變。結(jié)果 CCC組的occludin、claudin-1表達(dá)圖像分析指標(biāo)陽(yáng)性染色得分(MQS)值分別為(44.11±13.824、63)分、(443±23.589)分；對(duì)照組分別為(11.298±9.5776)分、(46.098±7.841)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.0034，P= 0.0384)。結(jié)論 CCC患兒膽總管上皮緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、claudin-1表達(dá)增高，提示膽總管上皮屏障破壞。

咬合蛋白；水閘蛋白；先天性膽總管囊腫

先天性膽總管囊腫(congenital choledochal cyst，CCC)好發(fā)于嬰幼兒，發(fā)病原因尚未完全闡明。一種學(xué)說(shuō)認(rèn)為在胚胎發(fā)育中，膽管由實(shí)心向空心演變時(shí)，有的節(jié)段由于發(fā)育緩慢，發(fā)生狹窄，近端發(fā)生擴(kuò)張。另一種學(xué)說(shuō)認(rèn)為是胰膽管合流異常所致[1]。CCC可以發(fā)生于任何年齡，10歲以下女性兒童多見(jiàn)，延誤診治可以導(dǎo)致膽囊炎、膽系結(jié)石。膽道存在慢性炎癥進(jìn)一步造成膽道上皮屏障的破壞，并導(dǎo)致膽道上皮細(xì)胞增殖核抗原活性增強(qiáng)、P53、K-ras過(guò)表達(dá)致使膽道上皮惡性轉(zhuǎn)化[2，3]，但對(duì)于CCC膽道上皮屏障破壞后緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)改變目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

膽道黏膜屏障功能的解剖基礎(chǔ)源于膽道上皮細(xì)胞間的緊密連接，緊密連接主要由緊密連接相關(guān)蛋白組成，緊密連接相關(guān)蛋白是非均質(zhì)復(fù)合物，包括咬合蛋白(occludin)、水閘蛋白(claudin) 家族、閉鎖小帶蛋白(zonula occludens，ZO)家族、連接黏附分子、扣帶蛋白(cingulin)、偶對(duì)蛋白(symplekin) 等[4，5]。occludin 蛋白準(zhǔn)確定位于緊密連接處，在維持細(xì)胞間的通透性、保持細(xì)胞間的跨上皮電阻有重要意義[6]。claudin 各成員在各種組織中的分布以及功能不同，研究表明claudin-1在消化道黏膜屏障中發(fā)揮重要作用[7，8]。

Fallon等[9，10]研究證明，肝外膽道膽汁淤積可以導(dǎo)致ZO-1表達(dá)增加，occludin表達(dá)2天下降，9天后逐步恢復(fù)到與對(duì)照組同樣水平，然而，Takakuwa 等[11]通過(guò)結(jié)扎大鼠膽總管6小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)occludin mRNA表達(dá)明顯增加。已有關(guān)于膽道上皮通透性增加導(dǎo)致膽道上皮損傷的報(bào)道[12]，而occludin、claudin-1是膽道上皮屏障中的重要分子，主要分布在在人的膽管和膽小管中[13]，而目前對(duì)于CCC膽管上皮損傷后緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)改變未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此闡明CCC導(dǎo)致膽總管緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)改變，將有助于了解膽道上皮屏障破壞機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究征得蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，采用回顧性分析方法，收集蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2011～2014年經(jīng)過(guò)影像學(xué)檢查、手術(shù)和病理證實(shí)的CCC患兒共12例，男7例，女5例，年齡5月至8歲，中位年齡3歲。收集患者膽總管囊腫標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行膽總管緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-1染色。對(duì)照組來(lái)源于我院新生兒或兒童死亡病例膽總管標(biāo)本，胎齡1天至8歲，中位胎齡為5天。

1.2 方法 ①免疫組化染色：采用SP法。將石蠟包埋的組織連續(xù)5 μm切片，切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育30 min 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡，pH 6.0 枸櫞酸鹽緩沖液微波爐抗原修復(fù)，10%山羊血清封閉非特異性染色。滴加不同比例稀釋的一抗occludin(1∶300) (Abcam，Inc.UK)、claudin-1(1∶250)(Abcam，Inc.UK)，置于4 ℃冰箱過(guò)夜后在37 ℃水浴恒溫箱復(fù)溫45分鐘。加生物素標(biāo)記二抗，在37 ℃水浴恒溫箱反應(yīng)20分鐘； 再加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，在37 ℃水浴恒溫箱反應(yīng)20分鐘，PBS沖洗4次，每次5 min。DAB-H2O2顯色，蘇木素淡復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照由Abcam，Inc(UK)提供的陽(yáng)性對(duì)照片，染色后均為陽(yáng)性；膽總管上皮細(xì)胞柱狀，細(xì)胞膜呈棕褐色為陽(yáng)性，在免疫組化中，以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，結(jié)果均為陰性。②免疫組化圖像分析：采用IPP 6.0 圖像分析軟件定量分析免疫組化染色情況。為了客觀分析occludin、claudin-1免疫組化陽(yáng)性染色的數(shù)量和分布，將所有免疫組化染色切片置于顯微鏡下，采用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)。在400倍視野下，每張切片于膽管上皮陽(yáng)性表達(dá)處選擇5～8個(gè)視野進(jìn)行拍片，然后保存在計(jì)算機(jī)上，進(jìn)行專業(yè)圖像分析。圖像分析選擇的指標(biāo)參照Mady等[14]的方法，計(jì)算陽(yáng)性染色得分(Mean qualifying score，MQS)，即陽(yáng)性染色比例與陽(yáng)性表達(dá)處平均光密度乘積。將每個(gè)切片所選擇的視野拍片并經(jīng)過(guò)圖像分析后，所得數(shù)值取平均值后即為該患者的分析指標(biāo)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS V8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。觀察指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)資料分布和方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)于不能滿足t檢驗(yàn)的，采用Wilcoxon法檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色圖像分析結(jié)果顯示，膽總管上皮細(xì)胞呈柱狀，claudin-1主要呈細(xì)胞膜表達(dá)，部分細(xì)胞質(zhì)核和細(xì)胞核呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。CCC組中claudin-1表達(dá)圖像分析指標(biāo)值MQS高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.0384)。occludin主要在細(xì)胞膜表達(dá)，呈中等程度表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核無(wú)明顯陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。CCC組中occludin表達(dá)圖像分析指標(biāo)值MQ高于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.0034)，見(jiàn)表1。

圖1 claudin-1免疫組化染色圖象 claudin-1主要呈細(xì)胞膜高表達(dá)，部分細(xì)胞質(zhì)核和細(xì)胞核呈弱陽(yáng)性表達(dá)

圖2 occludin免疫組化染色圖像 occludin于細(xì)胞膜呈中等程度表達(dá)

組別occlindinclaudin-1CCC組(n=12)44.11±13.82463.443±23.589對(duì)照組(n=10)11.298±9.577646.098±7.841Z-3.2978-2.2089P0.00340.0384

3 討論

緊密連接是使緊靠在一起的相鄰細(xì)胞形成環(huán)繞的物質(zhì)屏障結(jié)構(gòu)，具有細(xì)胞粘附、維持細(xì)胞極性和選擇性通透性作用[6，7]。膽管上皮存在緊密連接分子occludin、claudins等構(gòu)成膽管上皮屏障，將機(jī)體與膽道內(nèi)的外源性物質(zhì)隔離開(kāi)來(lái)，避免有毒物質(zhì)和病原微生物的侵襲和炎癥因子的損傷[10，11，15，16]。但CCC膽總管上皮屏障相關(guān)蛋白及其表達(dá)改變目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CCC膽總管中occludin、claudin1表達(dá)增高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明，CCC患者膽總管上皮緊密連接遭到破壞，屏障功能紊亂。Rahner 等通過(guò)結(jié)扎大鼠膽總管后，觀察緊密連接結(jié)構(gòu)與功能及膽汁淤積的關(guān)系，其研究結(jié)果表明，膽汁淤積程度與緊密連接完整性損傷相關(guān)[17]。此外，F(xiàn)allon等[9，10]通過(guò)結(jié)扎大鼠膽總管后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)occludin分布發(fā)生改變。Takakuwa等[11]通過(guò)結(jié)扎大鼠膽總管后，發(fā)現(xiàn)occludin mRNA表達(dá)明顯增加，而claudin1-2表達(dá)未受影響。以上研究表明膽汁淤積對(duì)于緊密連接蛋白表達(dá)和分布有影響。而本組資料中CCC患者膽總管遠(yuǎn)端合并痙攣，與膽道梗阻病理改變相類似，提示膽道上皮屏障功能受損，從而表現(xiàn)為膽道緊密連接蛋白表達(dá)的改變。而本研究中claudin-1表達(dá)升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CCC引起的病理改變不單純是膽汁淤積的問(wèn)題，緊密連接蛋白的改變可能與CCC合并胰膽管合流異常所致胰液反流有一定關(guān)系。研究表明毒素和藥物也可以影響膽管屏障功能，可以導(dǎo)致膽管上皮滲透性增加[18]。而CCC合并胰膽管合流異常患者中，由于胰液的返流，其內(nèi)大分子物質(zhì)具有很強(qiáng)的毒性，從而可以導(dǎo)致膽管屏障功能的損傷。膽管屏障受損致膽汁成分進(jìn)入膽道、肝臟間質(zhì)組織，膽汁誘發(fā)的細(xì)胞損傷參與膽道疾病發(fā)生。已有證據(jù)顯示膽道疾病的發(fā)病與膽道緊密連接和膽管功能有關(guān)[2，12]。

總之，本研究對(duì)CCC患兒膽總管緊密連接蛋白進(jìn)行了分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著CCC患兒膽總管上皮屏障緊密連接蛋白分子表達(dá)增高，膽總管上皮屏障受損；緊密連接蛋白受到多種信號(hào)通路動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，多種上皮細(xì)胞損傷因素通過(guò)激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路來(lái)?yè)p傷上皮屏障。但CCC膽道上皮受損的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Expression and significance of tight-junction associated protein in the common bile duct in pediatric patients with congenital choledochal cyst

WANG Xing-donga，WANG Jianb，GUO Wan-liangc，SHENG Maoc

(a.Department of Pathology，b.General Surgery Department，c.Radiology Department，Children’s Hospital of Soochow University，Suzhou 215003，China)

WANGJian

Objective The aim of this study was to investigate the alteration of tight junction-associated protein expression in the epithelium of common bile duct in pediatric patients with congenital choledochal cyst (CCC).Methods The common bile duct specimens were collected from 12 pediatric patients with CCC.The expression of the tight junction-associated protein related protein occludin and claudin-1 was determined by using immunohistochemistry and image processing system.Results Immunohistochemistry showed that the mean quick scores (MQSs) for occludin and claudin-1 were (44.11 ±13.824) and (63.443 ± 23.589)，respectively，which were significantly higher than those in the controls [occluding：(11.298 ± 9.5776) and claudin-1：(46.098±7.841)，P= 0.0034 and 0.0384，respectively].Conclusion The expression of tight junction-associated proteins occludin and claudin-1 is elevated in the epithelium of common bile duct in pediatric patients with CCC.This indicates that there is the development of disruption in common bile duct epithelial barrier.

Occludin； Claudin-1； Congenital choledochal cyst

江蘇省社會(huì)發(fā)展—重點(diǎn)病種規(guī)范化診療項(xiàng)目(編號(hào)：BE-2015643)，江蘇省衛(wèi)生計(jì)生委科研資助項(xiàng)目(編號(hào)：H201520)，蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(編號(hào)：SYS201563)

汪健，男，博士，博士生導(dǎo)師，教授。江蘇省重點(diǎn)學(xué)科“兒科學(xué)”首席學(xué)科帶頭人。主要研究方向：兒童消化道畸形臨床與基礎(chǔ)研究。

R726.1

A

1672-6170(2016)04-0017-03

2016-04-15；

2016-04-20)