胚胎著床內(nèi)膜中半乳凝素-3的表達(dá)變化及其在母胎界面與配體的共定位

王　璐　張　煒

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科　上海　200011)

胚胎著床內(nèi)膜中半乳凝素-3的表達(dá)變化及其在母胎界面與配體的共定位

王璐張煒△

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科上海200011)

【摘要】目的探討半乳凝素-3(galectin-3,gal-3)在小鼠胚胎著床子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及其與子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子整合素(integrin) β3的共表達(dá)定位。方法分別采用real-time PCR、Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)比較小鼠著床位點(diǎn)及非著床部位gal-3 mRNA和蛋白的表達(dá)及其與配體整合素 β3、纖連蛋白(fibronectin,FN)的免疫熒光共定位表達(dá)。結(jié)果小鼠著床處gal-3 mRNA和蛋白表達(dá)高于非著床部位(P<0.01)，其在著床位點(diǎn)主要與整合素β3共定位表達(dá),而與FN的共定位極少。結(jié)論gal-3在著床位點(diǎn)處高表達(dá)提示其在胚胎與子宮內(nèi)膜著床的過程中扮演重要角色,且在著床處gal-3主要通過與整合素β3共表達(dá)參與胚胎著床。

【關(guān)鍵詞】半乳凝素-3;胚胎著床;整合素β3;纖連蛋白

胚胎著床是處于活化狀態(tài)的胚泡與處于容受態(tài)的子宮內(nèi)膜間相互作用并進(jìn)入子宮內(nèi)膜的復(fù)雜過程。在著床過程中,包含了相當(dāng)復(fù)雜的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)的變化,通過胚胎和子宮內(nèi)膜間的一系列的分子對(duì)話和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),最終啟動(dòng)著床。半乳凝素-3(galectin-3,gal-3)是相對(duì)分子質(zhì)量為29 000～35 000的可溶性β-半乳糖苷結(jié)合蛋白,屬于半乳糖凝集素家族的一員。它廣泛分布于不同的細(xì)胞和組織中,主要通過與配體結(jié)合參與細(xì)胞的生長、黏附、侵襲、凋亡等過程,其配體包括整合素(integrin)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如層黏連蛋白、纖連蛋白(fibronectin,FN)等。研究表明gal-3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[1]。近年來發(fā)現(xiàn)該分子與胚胎早期發(fā)育和著床過程有關(guān)。最早發(fā)現(xiàn)人妊娠早、晚期的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的胚胎滋養(yǎng)層中均有g(shù)al-3表達(dá)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)其在人的子宮內(nèi)膜著床窗口期高表達(dá),并參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的生物學(xué)功能[2];在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)gal-3表達(dá)降低。進(jìn)一步的體外研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的gal-3表達(dá)與分泌受雌、孕激素的影響,且細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外的gal-3通過不同整合素配體的作用誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、黏附和凋亡行為,從而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的容受性建立。前期的研究結(jié)果都提示gal-3參與胚胎著床,但其在子宮內(nèi)膜與胚胎界面間有怎樣的改變以及作用的分子通路仍需要進(jìn)一步的研究。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑SPF級(jí)昆明小鼠購于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;芝加哥天藍(lán)購于美國Sigma公司;總RNA提取試劑盒購于美國Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購于北京天根生化科技公司;real-time PCR試劑盒購于大連Takara公司;單克隆小鼠抗gal-3、多克隆兔抗(FN)、HRP二抗及Alexa647羊抗兔二抗購于美國Abcam公司;單克隆大鼠抗gal-3和單克隆美洲倉鼠抗整合素β3購于美國Millipore公司;Alexa555羊抗大鼠二抗購于美國CST公司;FITC羊抗美洲倉鼠二抗購于美國eBioscience公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備SPF級(jí)昆明小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量23～25 g,飼養(yǎng)溫度25 ℃,光照周期12/12。按雌雄比例3∶1合籠交配,次晨檢查陰栓,發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠D1。在D5晨8:00～11:00經(jīng)小鼠尾靜脈注射1% 芝加哥天藍(lán),5 min后處死小鼠。在無菌條件下分別收集每只孕鼠的胚胎著床位點(diǎn)及非著床位點(diǎn)處組織,著床位點(diǎn)為芝加哥天藍(lán)染色處。而未孕小鼠同樣在無菌條件下收集子宮。從每只孕鼠一側(cè)子宮收集的標(biāo)本迅速于-80 ℃凍存,另一側(cè)的標(biāo)本經(jīng)固定和脫水后用OCT包埋,于-80 ℃保存。

real-time PCR檢測(cè)收集的標(biāo)本利用Trizol法抽提組織總RNA。RNA提取后用0.01% DEPC水溶解,采用BioTek多孔酶標(biāo)儀定量,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照熒光定量PCR方法進(jìn)行基因的半定量分析。引物序列[3]:gal-3,上游5′-CAGGAAAATGGCAGACAGCTT-3′,下游5′-CCCATGCACCCGGATATC-3′;β-actin,上游5′-AGATTACTGCTCTGGCTCCT-3′,下游5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,29個(gè)循環(huán),末次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

Western blot檢測(cè)將組織在RIPA和PMSF 裂解液中勻漿,冰上孵育30 min后高速離心,取上清即蛋白質(zhì)溶液,BCA蛋白定量測(cè)定蛋白濃度。提取的蛋白質(zhì)于-80 ℃保存。灌制SDS聚丙烯酰胺:15%分離膠和5%濃縮膠。取樣本蛋白50 μg加5×緩沖液混勻,95 ℃變性5 min,上樣。梯度蛋白作為分子量對(duì)照。濃縮膠電泳運(yùn)行60 V,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入分離膠后,把電壓加到120 V,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。切除濃縮膠后,將膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min,剪取與分離膠大小相同的PVDF膜,用轉(zhuǎn)移緩沖液浸透>10 min。剪6塊大小相同的Whatman 3 mm濾紙用轉(zhuǎn)移液浸透。自下而上依次疊放3張濾紙、PVDF膜、凝膠、另外3張濾紙,穩(wěn)定電流270 mA轉(zhuǎn)移2 h。取出PVDF膜,0.1% PBST洗膜,放入5%封閉液中,室溫?fù)u床震蕩1 h。將PVDF膜放入孵育盒,加入含單克隆小鼠抗小鼠gal-3(1∶1 000)和β-actin內(nèi)參(1∶1 000)的封閉液,4 ℃震蕩過夜。取出PVDF膜,用PBST洗滌5 min×3次。將膜轉(zhuǎn)入另一孵育盒中,加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(1∶3 000),室溫震蕩1 h,PBST洗滌20 min×3次。應(yīng)用LI-COR Odyssey Infrared Imaging System掃描檢測(cè),得出的IOD值經(jīng)內(nèi)參β-actin校正后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

免疫熒光檢測(cè)用切片機(jī)將包埋好的組織塊切成厚度為4 μm的切片。用PBS洗去切片上OCT,放入盛有0.01 mol/L枸櫞酸鈉的容器中,98 ℃熱修復(fù)20 min,室溫冷卻,PBS洗5 min×3次。滴加10% 羊血清室溫封閉30 min。滴加一抗混合液，含有大鼠單克隆gal-3抗體(1∶200)、美洲倉鼠單克隆整合素β3抗體(1∶50)和兔多克隆FN抗體(1∶50)，4 ℃孵育過夜。PBS 洗去一抗, 10 min×3次,滴加二抗混合液，含有Alexa Fluor555羊抗大鼠IgG(1∶500)、FITC羊抗美洲倉鼠IgG(1∶100)和Alexa Fluor 647羊抗兔IgG(1∶200)，37 ℃孵育30 min。PBS洗去二抗,10 min×3次，滴加DAPI及抗熒光淬滅劑。用中性樹脂封片,利用Leica TCS SP5 MP共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析和LSD法檢驗(yàn)兩組間均數(shù)的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

gal-3 mRNA在小鼠子宮著床位點(diǎn)與非著床位點(diǎn)的表達(dá)在小鼠子宮著床位點(diǎn)及非著床位點(diǎn)均可檢測(cè)到gal-3 mRNA的表達(dá),且其表達(dá)明顯強(qiáng)于未孕小鼠子宮內(nèi)膜(t=15.33和6.221,P<0.001)。著床位點(diǎn)gal-3 mRNA表達(dá)高于非著床位點(diǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.645,P<0.001,圖1)。

(1)vs.Non-pregnancy,(2)vs. Implantation site.

圖1gal-3 mRNA 在小鼠子宮著床處與

非著床處的表達(dá)比較

Fig 1Gal-3 mRNA expressions in implantation site,

inter-implantation site and non-pregnant endometria

gal-3蛋白在小鼠子宮著床位點(diǎn)與非著床位點(diǎn)的表達(dá)在著床位點(diǎn)和非著床位點(diǎn),早孕小鼠子宮內(nèi)膜上gal-3蛋白表達(dá)均強(qiáng)于未孕小鼠(t=11.029,P<0.001;t=3.878,P<0.05),而gal-3蛋白在著床位點(diǎn)的表達(dá)量明顯高于非著床位點(diǎn)(t=8.30,P<0.001,圖2)。

(1)vs. Non-pregnancy,(2)vs. Implantation site.

圖2gal-3在小鼠子宮著床處與非著床處的蛋白表達(dá)

Fig 2gal-3 expression in implantation site,

inter-implantation site and non-pregnant endometria

gal-3 及其配體整合素β3、FN在小鼠子宮著床位點(diǎn)的共定位早孕小鼠子宮著床位點(diǎn)及非著床位點(diǎn)處均有g(shù)al-3及其配體整合素β3、FN的表達(dá),gal-3及其配體整合素β3主要定位于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,而FN則主要定位于間質(zhì)細(xì)胞及胚胎。著床位點(diǎn)gal-3及整合素β3的表達(dá)明顯強(qiáng)于非著床位點(diǎn),而FN的熒光強(qiáng)度在著床位點(diǎn)及非著床位點(diǎn)無明顯區(qū)別(圖3)。gal-3及整合素β3的共定位表達(dá)結(jié)果顯示，在著床位點(diǎn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞多處可見兩者共表達(dá),而整合素β3是gal-3的主要配體,說明兩者在著床位點(diǎn)處可能廣泛結(jié)合(圖4A)。但gal-3、整合素β3和FN的共定位結(jié)果則提示FN未參與gal-3和整合素β3的結(jié)合(圖4B)。

討論

gal-3是一種多功能分子,其主要與細(xì)胞表面的糖基化蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白結(jié)合,包括整合素、細(xì)胞外基質(zhì)分子(extracellular matrix,ECM)、信號(hào)分子ras等,gal-3通過與配體結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)功能,如細(xì)胞生長、增殖、黏附、遷移及凋亡等[4-5]。已在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)gal-3高表達(dá),發(fā)現(xiàn)該基因主要參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。gal-3通過與相應(yīng)配體結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增長、抑制其凋亡,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。而胚胎著床與腫瘤種植轉(zhuǎn)移在生物學(xué)行為方面有高度的相似性,只是前者是有節(jié)制的,而后者是失去控制的無限擴(kuò)張。

gal-3是相對(duì)分子質(zhì)量為29 000～35 000的可溶性β-半乳糖苷結(jié)合蛋白。其結(jié)構(gòu)在gal家族中很獨(dú)特,1條多肽鏈形成2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:富含甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸殘基的重復(fù)性膠原樣序列和羧基末端的CRD[6-8]。羧基末端的CRD是gal-3作為凝集素家族的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域,同時(shí)也是其發(fā)揮凝集素活性與特定配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。gal-3廣泛分布于分布于細(xì)胞內(nèi)外,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、黏附、侵襲、凋亡等過程。

我們的前期研究利用抑制性差減雜交技術(shù)篩選出一些與子宮內(nèi)膜容受性建立相關(guān)的基因,gal-3是其中之一[9],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在分泌中期子宮內(nèi)膜達(dá)最高峰,且定位于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞[2],由此我們就gal-3對(duì)子宮內(nèi)膜容受性形成的影響進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)gal-3對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖、黏附和凋亡具有調(diào)節(jié)作用。gal-3可影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞上整合素β3的表達(dá),利用整合素β3抗體可阻斷gal-3對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖及黏附的作用,提示gal-3通過整合素β3通路可能激活了細(xì)胞增殖和黏附的調(diào)控信號(hào),以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的生長和黏附[10]。子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜上gal-3表達(dá)降低,子宮內(nèi)膜異位癥是引起不孕的原因之一,其中g(shù)al-3表達(dá)下調(diào)可能使子宮內(nèi)膜容受性建立不全,引起胚胎著床失敗[11]，進(jìn)一步提示該分子與子宮內(nèi)膜容受性形成密切相關(guān)。但gal-3在子宮內(nèi)膜與胚胎界面間產(chǎn)生了怎樣的影響仍需要進(jìn)一步的研究。因此,我們對(duì)gal-3及其配體在著床期母胎界面的表達(dá)及定位進(jìn)行了深入研究。

本研究利用小鼠早期胚胎著床模型,在體研究了gal-3在著床位點(diǎn)和非著床位點(diǎn)的表達(dá)變化,首次揭示gal-3 mRNA及蛋白在孕小鼠子宮上表達(dá)增加,且著床部位的表達(dá)明顯高于非著床部位。gal-3可能在著床處內(nèi)膜的容受性形成過程中扮演重要角色,它可能介導(dǎo)了著床局部子宮內(nèi)膜與胚胎的黏附和植入。

胚胎著床過程首先由胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞在子宮內(nèi)膜上黏附,之后入侵并植入其中,母胎界面上的黏附分子相互作用介導(dǎo)母胎黏附。已證實(shí)整合素是與胚胎著床關(guān)系最為密切的一類黏附分子,研究發(fā)現(xiàn)其中的整合素13、v3、11在“著床窗口期”開放時(shí)表達(dá),在“著床窗口期”關(guān)閉時(shí)消失,因此學(xué)者們普遍認(rèn)為在胚胎和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞接觸早期,是整合素黏附分子和配體相互作用介導(dǎo)了母胎間的黏附,故整合素是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床的重要分子[12-14]。整合素和ECM都是gal-3的重要配體,同時(shí)整合素和ECM又互為配受體,gal-3可以與整合素/ECM單價(jià)結(jié)合抑制黏附,或雙價(jià)結(jié)合/多價(jià)結(jié)合形成多聚體復(fù)合物增強(qiáng)黏附;也可以改變整合素與ECM的親和力進(jìn)而調(diào)節(jié)黏附;gal-3還可以調(diào)節(jié)整合素的表達(dá)和活性。那么,gal-3在著床位點(diǎn)的高表達(dá)是否通過整合素或ECM的分子通路調(diào)節(jié)母胎界面的黏附、侵襲和植入？為了探索gal-3在母胎界面作用的分子通路,我們觀察并比較了著床位點(diǎn)和非著床位點(diǎn)gal-3與配體整合素3、FN的免疫熒光共定位,結(jié)果顯示:gal-3與整合素3主要表達(dá)在著床期的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,而FN則主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞和胚胎上;gal-3與整合素3在著床位點(diǎn)的子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)大量的熒光共定位表達(dá),強(qiáng)度遠(yuǎn)超出非著床位點(diǎn),但gal-3與FN的共定位表達(dá)無論在著床位點(diǎn)還是非著床位點(diǎn)都很少。gal-3與整合素β3而非FN共同在著床位點(diǎn)處介導(dǎo)母胎間對(duì)話,提示gal-3可能與整合素β3共同介導(dǎo)母胎間的黏附,參與內(nèi)膜容受性的建立。

總之,gal-3在胚胎著床位點(diǎn)高表達(dá)提示其在胚胎著床位點(diǎn)處內(nèi)膜容受性的建立中扮演重要角色,且gal-3及其配體整合素β3在著床位點(diǎn)處介導(dǎo)母胎間黏附。但gal-3與其配體整合素β3結(jié)合的具體機(jī)制和功能仍需進(jìn)一步的研究。對(duì)gal-3的研究可能為某些原因引起的不孕的治療提供依據(jù),利用gal-3對(duì)著床過程的干擾也可能為計(jì)劃生育方法的研發(fā)提供新的思路。

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The expression change of galectin-3 and co-localization with its ligands in implantation site of endometrium

WANG Lu, ZHANG Wei△

(DepartmentofReproductiveEndocrinology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200011,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of galectin-3 (gal-3) in mouse′s implantation site of endometrium and the co-localization with integrin β3 ,which is the marker molecular molecular for the receptivity of endometrium.MethodsGal-3 mRNA and protein expressions were detected by real-time PCR and Western blot analysis.Immunofluorescence was used to detect the co-locatization of gal-3 and its ligands of integrin β3 and fibronectin(FN).ResultsCompared with inter-implantation site,gal-3 mRNA and protein expressions in mouse implantation site of endometrium were significantly increased (P<0.01).Moreover,the immunofluorescence intensity of the co-localization of integrin β3 and gal-3 was stronger in implantation site than that in inter-implantation site,while the co-localization of FN and gal-3 was very weak.ConclusionsGal-3 expresses highly in implantation site,and co-expresses with integrin β3 at maternal-fetal interface. It indicates that gal-3 plays an important role in the attachment between embryo and endometrium.

【Key words】galectin-3;embryo implantation;integrin β3;fibronectin

【中圖分類號(hào)】R321.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.008

(收稿日期:2015-08-18;編輯:段佳)

教育部博士點(diǎn)基金(20120071110074);上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人計(jì)劃項(xiàng)目(12XD1401200)

△Corresponding authorE-mail:zhangwei623@hotmail.com

*This work was supported by the Ph.D Program Foundation of Ministry of Education,China (20120071110074) and the Program of Subject Chief Scientist of Shanghai (12XD1401200).