NaHCO3及培養時間對球等鞭金藻（Isochrysis galbana）生長、蛋白質和脂肪酸組成的影響

王星宇，黃旭雄，2，3，楊碧蓮

1.農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海2013062.上海市水產養殖工程技術研究中心，上海2013063.水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海201306

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NaHCO3及培養時間對球等鞭金藻（Isochrysis galbana）生長、蛋白質和脂肪酸組成的影響

王星宇1，黃旭雄1，2，3，楊碧蓮1

1.農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海201306
2.上海市水產養殖工程技術研究中心，上海201306
3.水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海201306

摘要：本文研究了培養液中添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL NaHCO3對球等鞭金藻（Isochrysis galbana）生長、細胞蛋白質含量及脂肪酸組成的影響，并進一步探討了添加適宜NaHCO3后不同培養階段對細胞營養組成的影響。結果表明：NaHCO3對球等鞭金藻的生長和細胞營養價值有顯著影響。批次培養模式下培養液中添加1.5 mg/mL NaHCO3可以獲得最大細胞密度和比生長率。球等邊金藻細胞中蛋白質含量隨培養液中NaHCO3添加量的增大而顯著減少；而細胞中得單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著增加，多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著降低。在添加1.5 mg/mL NaHCO3的培養條件下，不同培養階段的藻細胞蛋白和脂肪酸組成也有顯著變化，隨著培養時間的延長，SFA和MUFA含量逐漸增加，PUFA含量則顯著減少。培養液中添加NaHCO3有助于提升球等鞭金藻作為生物柴油原料的品質。

關鍵詞：球等鞭金藻；NaHCO3；生長；蛋白質；脂肪酸

球等鞭金藻（Isochrysis galbana）因其無細胞壁，易消化，富含高不飽和脂肪酸等營養物質，一直被認為貝類等水產無脊椎動物苗種的優良的餌料微藻［1］，也一度被視為是生產DHA、EPA等生理活性物質的潛力藻種［2，3］。近些年，隨著微藻生物柴油開發成為微藻應用研究的又一熱點，球等鞭金藻因其經環境誘導后可以蓄積高比例油脂的特點，還被視為生產微藻生物柴油的優良原料［4］。然而無論是作為餌料微藻還是生物柴油原料，獲得高的生物量及細胞中高的目標營養物質含量是球等鞭金藻實現產業化開發的重要前提。因此，開展培養條件及營養鹽濃度對球等鞭金藻生長及細胞組成的影響研究，是實現球等鞭金藻產業化開發的基礎性工作。多種環境因子及培養液中營養素水平等培養條件對球等鞭金藻生長和細胞組成的影響已有報道［5-7］。二氧化碳是藻類進行光合作用的底物，培養液中補充二氧化碳在多種微藻培養中已被證實可以促進藻類的生長［8，9］。同時，培養液中的二氧化碳可以H2CO3、HCO3-及CO32-形式存在，三者構成了培養液中二氧化碳緩沖體系。已有的研究證實，某些藻類如柵藻（Scenedesmus sp.）［10］、微綠球藻（Nannochloropsis salina）［11］和小球藻（Chlorella kessleri）［12］可以利用HCO3-實現快速生長，而另一些藻類培養過程中添加HCO3-則并無促生長效果［8］。梁英等報道了培養液中NaHCO3濃度對球等鞭金藻的生長特性有顯著影響［13］。然而，添加NaHCO3對球等鞭金藻細胞營養組成的影響未見報道。此外，處于不同生長階段的藻細胞其細胞營養組成會有巨大差異［14，15］，在培養液中補充NaHCO3后，培養階段對藻細胞的營養組成的影響也未見報道。本研究探討了培養液中添加NaHCO3及培養時間對球等鞭金藻生長和細胞營養價值的影響，以期為高效開發球等鞭金藻積累基礎性數據。

1　材料與方法

1.1藻種來源

球等鞭金藻（Isochrysis galbana）來自于上海海洋大學微藻藻種室。藻種在溫度25℃，光照強度3000 lux，鹽度26的滅菌海水中采用采用f/2配方培養基［16］進行逐級擴大培養后用于試驗。

1.2培養液中添加不同水平NaHCO3對球等鞭金藻生長及細胞組成影響試驗

以NaHCO3為碳源，設置5個NaHCO3的質量濃度分別為0，0.5，1，1.5和2 mg/mL的試驗組，每個梯度3個平行。培養在1000 mL三角燒瓶中進行，初始接種密度3×105cell/mL，將三角燒瓶置于光照培養箱內培養（L：D=18：6），培養溫度25℃，光照強度3000 lux，鹽度26。培養周期10 d，每天定時搖瓶3次。培養期間每日定時取樣計數藻細胞密度。藻細胞密度的測定采用XB-K-25血球計數板計數法，每個樣品平行測定4次。

培養結束時，搖勻取30 mL藻液經混合纖維素酯濾膜（孔徑為0.45 μm）過濾，置于烘箱中105℃烘干至恒重，得到細胞干重。另搖勻取1 mL藻液加入1 mL 2N NaOH，95℃水浴10 min，冷卻至室溫，加入1 mL 1.6N HCl中和，離心后取上清，采用福林-酚試劑測定蛋白質含量［17］。剩余藻液經離心后，冷凍干燥用于脂肪酸組成的測定。

1.3培養時間對球等鞭金藻生長及細胞組成影響試驗

根據1.2試驗結果，篩選出5組中球等鞭金藻生長密度最高組（1.5 mg/mL）為放大試驗組，將擴大培養后的藻液接種于60 L柱狀氣升式光生物反應器（高1 m，直徑0.3 m）中培養，初始接種密度3×106cell/mL。反應器中內置LED光源，光照強度2500 lux，連續光照，室溫培養。培養周期10 d，培養期間每日定時取樣計數藻細胞密度，隔天定期收獲5 L藻液用于細胞蛋白和脂肪酸組成的測定。

1.4脂肪酸的測定

細胞脂肪酸組成的測定參照Griffiths［18］等的方法，移取一定量藻粉依次加入甲醇鈉（NaOMe，0.5 mol/L）和BF3-甲醇溶液（14%）進行兩步甲酯化，提取出含有脂肪酸甲酯的正己烷-甲苯混合物，轉移至進樣瓶。然后采用氣-質聯用儀（Agilent 7890A/5975C）分析脂肪酸甲酯，毛細管柱為Supelco Omegawax320（30.0×0.32 mm×0.25 μm）。根據脂肪酸標準品（Sigma，美國）的分析圖譜和保留時間對樣品脂肪酸進行定性分析，利用峰面積歸一化法計算各脂肪酸的相對百分含量，每組樣品平行測量3次。

1.5數據統計與分析

藻細胞生長的比生長率μ計算公式如下：μ=（lnXt-lnX0）/T

其中，X0為培養初始藻細胞密度，Xt為經T時間后培養液中的藻細胞密度。

根據脂肪酸組成預測微藻生物柴油的品質，其中十六烷值（Cetane Number，CN）的計算參考Piloto-Rodríguez［19］等人的方法進行；運動黏度的計算參照［20］的方法進行；碘值參照［21］的方法進行。

實驗結果以平均值±標準差（mean±SD）表示。數據采用SPSS11.0軟件（SPSS Inc.，USA）進行單因子方差分析（One-Way ANOVA），并用Duncan氏檢驗進行多重比較，差異顯著性水平為P＜0.05。

2　結果與分析

2.1培養液中添加不同水平NaHCO3對球等鞭金藻生長及細胞組成影響

培養液中添加不同濃度的NaHCO3對球等鞭金藻生長的影響如圖1所示。在培養前期，碳酸氫鈉添加與否對球等鞭金藻細胞生長無顯著影響（P＞0.05）。培養第7 d，A組（未添加NaHCO3）的細胞濃度開始下降，而B、C、D、E組濃度繼續增加，碳酸氫鈉對藻細胞生長的影響開始顯現。培養第9 d，D、C和B組藻細胞密度顯著高于E和A組（P＜0.05），且D、C和B組藻細胞密度分別達到最大值，其中D組最大密度為2.64×106cell/mL。培養第10 d，各組藻細胞密度均較前一日有所下降。

圖1　培養液中添加不同濃度的NaHCO3對球等鞭金藻生長的影響Fig.1 Effect of NaHCO3concentration on growth of the micro-algae Isochrysis galbana

由不同組別的藻細胞比生長率（表1）也可知，培養8 d，D和E組比生長率顯著高于A組（P＜0.05）；培養9 d和10 d，A組比生長率顯著低于其他組（P＜0.05）。

表1　不同濃度的NaHCO3對球等鞭金藻比生長速率（μ）的影響Table 1 Effect of NaHCO3concentration on specific rate of growth of Isochrysis galbana

經過10 d培養，培養液中碳酸氫鈉濃度對藻細胞蛋白質含量有顯著影響（P＜0.05）（圖2）。隨著培養液中碳酸氫鈉濃度的增加，藻細胞中蛋白質含量顯著降低。E組藻細胞蛋白質含量顯著低于其他組（P＜0.05），而C和D組無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于A和B組（P＜0.05），A和B組間細胞蛋白質含量無顯著差異（P＞0.05）。

圖2　培養液中添加不同濃度的NaHCO3對球等鞭金藻蛋白質含量的影響Fig.2 Effect of NaHCO3concentration on protein content of Isochrysis galbana

從各處理組球等鞭金藻細胞脂肪酸組成（表2）可知，球等鞭金藻細胞中主要的脂肪酸為18：1n9、16：0、14：0、18：4n3、18：3n3和22：6n3。隨著培養液中NaHCO3添加量的增加，不同脂肪酸呈現不同的變化趨勢，14：0呈現先降低后升高的變化；16：0和18：1n9含量顯著增加；18：3n3和18：4n3含量顯著降低；22：6n3含量呈現先升高后降低的變化。隨著培養液中NaHCO3添加量的增加，飽和脂肪酸（SFA）呈波動變化，總體增加；單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著增加；而多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著降低。

表2　培養液中添加NaHCO3對球等鞭金藻細胞脂肪酸組成的影響Table 2 Effect of NaHCO3concentration onfatty acid profiles of the micro-algae Isochrysis galbana

表3　培養液中添加NaHCO3對球等鞭金藻細胞生物柴油品質的影響Table 3 Effect of NaHCO3concentration on biodiesel quality of the micro-algae Isochrysis galbana

隨著培養液中碳酸氫鈉添加量的增加，運動黏度有所提高，碘值逐步減少，十六烷值逐步增大。

2.2培養時間對添加1.5 mg/mL NaHCO3的球等鞭金藻生長和細胞組成的影響

圖3所示為添加1.5 mg/mL NaHCO3條件下球等鞭金藻在60 L光生物反應器中的生長曲線?？芍?，1～7 d藻細胞密度隨培養時間的延長而增加，在第7 d藻細胞密度達到最大值，為4.4×106cell/mL。之后細胞密度隨培養時間的延長而逐漸降低。

圖3　添加1.5 mg/mLNaHCO3條件下球等鞭金藻在60 L光生物反應器中的生長曲線Fig.3Thegrowthcurveof Isochrysisgalbanaculturedin60 Lbioreactorwithmediumsupplementedwith1.5mg/mLNaHCO3

培養階段對球等鞭金藻細胞蛋白質含量有顯著影響（P＜0.05）（圖4）。隨著培養時間的延長，藻細胞中蛋白質含量有所降低。第9 d藻細胞蛋白質含量顯著低于其他組（P＜0.05），而第5 d和第7 d藻細胞蛋白質含量無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于第1 d和第3 d（P＜0.05），第1 d和第3 d藻細胞蛋白質含量無顯著差異（P＞0.05）。

圖4　培養時間對添加1.5 mg/mL NaHCO3的球等鞭金藻細胞蛋白質含量的影響Fig.4EffectofgrowthphaseoncellularproteincontentofIsochrysisgalbanaculturedinmediumsupplementedwith1.5mg/mLNaHCO3

由不同培養階段球等鞭金藻脂肪酸組成可知，在添加1.5 mg/LNaHCO3條件下，隨著培養天數的增加，14：0、16：0、18：1n9和18：2n6含量逐漸增加，18：3n-3、18：4n-3和22：6n3含量顯著減少；SFA 和MUFA含量逐漸增加，PUFA含量則顯著減少（表4）。

表4　培養時間對添加1.5 mg/mL NaHCO3的球等鞭金藻細胞脂肪酸組成的影響Table4EffectofgrowthphaseonfattyacidprofilesofIsochrysisgalbanaculturedinmediumsupplementedwith1.5mg/mLNaHCO3

表5　培養時間對添加1.5 mg/mL NaHCO3的球等鞭金藻細胞生物柴油質量的影響Table5 EffectofgrowthphaseonbiodieselqualityofIsochrysisgalbanaculturedinmediumsupplementedwith1.5mg/mLNaHCO3

隨著培養時間的延長，運動黏度逐漸增加，碘值逐漸降低，十六烷值逐步增大。

3　討論

大多數微藻的生長是基于光合作用并從外界環境中獲取可溶性無機碳用于碳的固定，藻類的光合作用和碳固定過程受環境因素的調控，因此，環境因素的改變會影響到藻類的生長及細胞組成［22，23］。一般認為，藻類的光合作用的碳源底物是二氧化碳，然而，在正常海水中，因其pH呈堿性（約8.1左右），超過90%的可溶性無機碳是以HCO3-形式存在的，且從HCO3-到CO2的自發轉化率低［24］。微藻對環境中的HCO3-利用存在兩種機制［25，26］：一方面，微藻能夠從外界環境中跨質膜運輸HCO3-到胞液中，然后在胞液內通過胞內碳酸酐酶的作用將HCO3-分解成CO2供光合作用所需。另一方面，有些微藻分泌的細胞外的碳酸酐酶也可以將環境中的HCO3-催化成CO2，然后CO2跨膜被藻細胞利用。然而，不同的藻類產生碳酸酐酶的部位及其活性是不一樣的，由此也決定了不同藻類利用環境中HCO3-的能力是不一樣的［27，28］。White等［11］研究發現，與不添加組相比，在培養液中添加1 g/L碳酸氫鈉，可以提高四爿藻（Tetraselmis suecica）和微綠球藻（Nannochloropsis salina）培養的細胞密度，然而，培養液中碳酸氫鈉濃度不會改變四爿藻細胞的特殊生長率（SGR），且微綠球藻的SGR隨碳酸氫鈉濃度的增加而降低。Gardner等［29］發現培養液中添加碳酸氫鈉會抑制柵藻（Scenedesmus sp.）的繁殖，但對三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）不起作用。Yhe等［30］認為，培養液中添加1000 mg/L的碳酸氫鈉對提升小球藻（Chlorella vulgaris ESO-31）生物量是最好的。Pancha等認為在BG-11培養基中添加0.6 g/L碳酸氫鈉可以增加柵藻的生物量［10］。在培養液中添加不同濃度的NaHCO3對等鞭藻3011和塔溪堤生長影響明顯，對綠色巴夫藻的影響程度明顯小于其它兩種金藻。3株海洋微藻的細胞濃度在NaHCO3濃度最大時（1600 mg/L）達最大值［8］。戴玉蓉等［31］發現在5種微藻的培養液中添加1000 mg/L的NaHCO3，后藻細胞濃度比不加NaHCO3的對照組顯著提高。塔胞藻（Pyramimonas sp.）和小球藻（Chlorella spp.）的細胞濃度都在NaHCO3質量濃度為1200 mg/L時達到最大值；新月菱形藻（Nitzschia closterium）的細胞濃度在NaHCO3質量濃度為400 mg/L時達到最大值［8］。本研究中，培養液中添加1.5 g/L的碳酸氫鈉，球等鞭金藻的比生長率及細胞密度均是最高的，添加2 g/L的碳酸氫鈉組球等鞭金藻的比生長率及細胞密度反而有所下降。上述研究表明，培養液中添加適量碳酸氫鈉對微藻類的促生長作用具有種的特異性。有研究表明，四爿藻更喜歡利用胞外碳酸酐酶將HCO3-催化成CO2然后轉運至進細胞內，而微綠球藻傾向于將主動轉運至細胞內在經碳酸酐酶作用［32］。對于那些添加碳酸氫鈉可以促生長的藻類，適量添加碳酸氫鈉促生長的機理推測與兩方面有關：一方面，培養液中添加的碳酸氫鈉增加光合作用的底物濃度從而有利于光合作用。已有的研究也證實，培養液中添加適量碳酸氫鈉可以提升四爿藻和微綠球藻的光合作用效率（Fv/Fm）［11］；另一方面培養液中添加的碳酸氫鈉促進了藻細胞對其他營養鹽的吸收。在添加碳酸氫鈉組培養液中微藻對培養液中氮的利用顯著增加［11］。而過高的碳酸氫鈉添加量抑制藻類生長，可能與培養液中過量添加的碳酸氫鈉導致培養液pH值過高有關［30］。pH超過藻類的最適范圍會抑制藻類的生長，同時過高的pH會導致水體中微量礦物元素的沉淀，同時導致無機碳向CO32-轉變，而光合作用的藻類是不能利用CO32-［33］。

本研究中，培養液中添加碳酸氫鈉對球等鞭金藻的細胞蛋白質含量和脂肪酸組成有顯著影響，隨著培養液中碳酸氫鈉添加量的增大，藻細胞中蛋白質含量逐漸降低，單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著增加；而多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著降低。類似的結果在其他藻類中也得到證實。在添加2 g/L碳酸氫鈉培養液中，微綠球藻細胞SFA含量顯著增加，MUFA含量顯著降低［11］。藻細胞蛋白質含量隨碳酸氫鈉添加量的增大而降低的原因，推測與培養液中C/N比增大有關。培養液中高的C/N比在某種程度上意味著N的相對缺乏，而氮缺乏會抑制藻細胞合成蛋白質，轉而將能量以脂類和碳水化合物的形式貯存在細胞中［34］。White等證實，四爿藻和微綠球藻的細胞脂肪含量均會隨培養液中碳酸氫鈉的增加而增加。培養液中添加碳酸氫鈉也有助于柵藻和三角褐指藻細胞蓄積脂肪［29］。而柵藻細胞在缺氮和添加碳酸氫鈉的情況下則蓄積大量的碳水化合物［10］。

本研究中，隨著培養天數的增加，細胞蛋白質含量降低，SFA和MUFA含量逐漸增加，PUFA含量顯著減少。已有的文獻也證實了這種規律。黃旭雄［14］等研究發現，培養階段顯著影響微綠球藻的蛋白質含量、脂肪含量、氨基酸含量及脂肪酸組成，批次培養模式下隨著培養時間的延長，藻細胞蛋白質含量顯著降低，SFA含量顯著增加，PUFA含量顯著降低。等鞭金藻的粗蛋白質含量隨培養時間的延長而降低［35］。培養階段影響藻細胞生化組成的原因，推測與培養液中營養鹽的變化有關。由于藻類生長過程中不斷吸收利用培養液中的營養鹽，導致營養鹽的缺乏有關。而營養鹽缺乏，尤其是氮的缺乏，引起藻細胞生化組成變化的顯著特點就是細胞蛋白質含量降低，脂肪含量增加，飽和脂肪酸增加，多不飽和脂肪酸脂肪酸降低［34］。本研究中，對比前后2次試驗的藻細胞營養組成，可以發現在光生物反應器中開展不同培養時間對藻細胞營養組成試驗中，球等鞭金藻表現出更低的蛋白質含量，這與兩次實驗的培養條件不完全一致有關。光生物反應器中的試驗因接種密度高，且連續充氣，推測氮脅迫程度相比第一個試驗更加強烈，從而表現出更低的細胞蛋白質含量。

生物柴油即脂肪酸甲酯，是一種可再生且可生物降解的能源，目前已作為傳統生物柴油的替代品加以利用。據Kevin J.Harrington［36］的研究表明，作為柴油替代品的理想物質應當具有的分子結構是：有較長的碳直鏈；含有一定量的氧元素；分子結構盡量沒有或只有很少的碳支鏈；分子中不含有芳香烴結構。而本實驗中球等鞭金藻的主要組成為C16和C18脂肪酸甲酯，因此，可作為一種柴油替代品。運動粘度是液體流動時內摩檫力的量度，其值隨溫度升高而降低，是衡量燃料流動性能及霧化性能的指標，輕質柴油適宜的運動粘度為1.9～6.0 mm2/s［37］。本試驗中，各試驗組運動粘度變化不大，在3.78～3.91 mm2/s之間，均符合生物柴油品質標準。碘值是表示有機化合物中不飽和程度的一種指標，是對油脂分子碳鏈不飽和度的度量，指100 g物質中所能吸收（加成）碘的克數。而碘值高，CN值就低，CN值表示柴油燃料的點火延遲時間和燃燒性能，是反映微藻生物柴油的重要指標，一般認為，適宜的柴油CN值應為45～65［39］。若CN太大，則燃料與空氣未經適宜混合就予以燃燒而導致燃燒不完全并產生黑煙。若CN太小則燃料發火困難，不易啟動并易導致發動機爆震［38］。藻細胞的脂肪酸組成是影響CN的重要因素。本研究中的球等鞭金藻的CN值介于47.56～54.92，均處于生物柴油合適的范圍，且隨著培養液中NaHCO3添加量和培養時間的延長，CN有所改善。

綜上所述，一次性培養模式下，培養液中添加NaHCO3可以提升球等鞭金藻培養密度和比生長率，降低細胞蛋白質含量和脂肪酸中PUFA含量，提升SFA比例，提高運動黏度和CN值；而增加培養時間也可以降低藻細胞蛋白質含量和脂肪酸中PUFA比例。添加NaHCO3可作為提升球等鞭金藻作為生物柴油原料品質的有效策略。

參考文獻

［1］戴俊彪，吳慶余.室外培養海洋單細胞微藻的生長及生化組分［J］.海洋科學，2000，24（6）：29-32

［2］Reitan KI，Rainuzzo JR，Olsen Y. Effect of nutrient l imitat ion on fatty acid and lipid content of marine microalgae［J］. Journal of Phycology，1994，30：972-979

［3］Khozin-Goldberg I，Iskandarov U，Cohen Z. LC-PUFA from photosynthetic microalgae：occurrence，biosynthesis，and prospects in biotechnology［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91：905-915

［4］Roopnarain A，Gray VM，Sym S. The influence of nitrogen stress on Isochrysis galbana U4，a candidate for biodiesel production［J］. Phycology Research，2014，62（4）：237-249

［5］孫利芹，楊林濤.環境因子對球等鞭金藻脂肪酸含量和組成的影響［J］.食品研究與開發，2006，27（5）：11-13

［6］孫穎穎，孫利芹，王長海.球等鞭金藻的培養條件研究［J］.海洋通報，2005，24（3）：93-96

［7］Sánchez S，Martínez M，Espinola F. Biomass production and biochemical variability of the marine microalga Isochrysis galbana in relation to culture medium［J］. Biochemical Engineering Journal，2000，6（1）：13-18

［8］梁英，麥康森，孫世春，等.NaHCO3濃度對塔胞藻、小球藻和新月菱形藻生長的影響［J］.黃渤海研究，2001，19（2）：71-76

［9］滕懷麗，黃旭雄，周洪琪，等.充氣方式對鹽藻生長、細胞營養成分及氮磷營養鹽利用的影響［J］.水產學報，2000，34（6）：942-948

［10］Pancha I，Chokshi K，Ghosh T，et al. Bicarbonate supplementation enhanced biofuel production potential as well as nutritional stress mitigation in the microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077［J］. Bioresource technology，2015，193：315-323

［11］White DA，Pagarette A，Rooks P，et al. The effect of sodium bicarbonate supplementation on growth and biochemical composition of marine microalgae cultures［J］. Journal of Applied Phycology，2013，25：153-165

［12］El-Ansari O，Colman B. Inorganic carbon acquisition in the acid-tolerant alga Chlorella kessleri［J］. Physiologia of Plantarum，2015，153（1）：175-182

［13］梁英，麥康森，孫世春. NaHCO3濃度對等鞭藻3011，等鞭藻塔溪堤品系和綠色巴夫藻生長的影響［J］.中國水產科學，2001，8（1）：37-40

［14］黃旭雄，周洪琪，朱建忠，等.不同生長階段微綠球藻的營養價值［J］.水產學報，2004，28（4）：477-480

［15］Roopnarain A，Sym SD，Gray VM. Time of culture harvest affects lipid productivity of nitrogen-starved Isochrysis galbana U4（Isochrysidales：Haptophyta）［J］. Aquaculture，2015，438：12-16

［16］成永旭.生物餌料培養學［M］.北京：中國農業出版社，2005

［17］Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］. Journal of Biological Chemistry，1951，193：265-275

［18］Griffiths MJ，Van Hille RP，Harrison ST. Selection of direct transesterification as the preferred method for assay of fatty acid content of microalgae［J］. Lipids，2010，45（11）：1053-1060

［19］Piloto-Rodríguez R，Sánchez-Borroto Y，Lapuerta M，et al. Prediction of the cetane number of biodiesel using artificial neural networks and multiple linear regression［J］. Energ Convers Manage，2013，65：255-261

［20］段敏.小球藻油制備生物柴油的試驗和優化工藝研究［D］.杭州：浙江大學，2011

［21］Kalayasiri P，Jeyashoke N，Krisnangkura K. Survey of seed oils for use as diesel fuels［J］. Journal of the American Oil Chemists'Society，1996，73（4）：471-474

［22］Hu Q. Enviromental effects on cell composition［M］//Amos and Richard. Handbook of microalgal culture，biotechnology and applied phycology. Oxford：Blackwell Publishing，2004：83-94

［23］Wei L，Huang X，Huang Z，et al. Orthogonal test design for optimization of lipid accumulation and lipid property in Nannochloropsis oculata for biodiesel production［J］. Bioresource technology，2013，147：534-538

［24］Skirrow G.Thedissolved gasescarbondioxde［C］//Riley JP，Skirrow G. Chemical oceanography.Academic.London：1975：1-92

［25］Bozzo GG，Colman B，Matsuda Y. Active transport of CO2and bicarbonate is induced in response to external CO2concentration in the green alga Chlorella kessleri［J］. Journal of Experimental Botany，2000，51：1341-1348

［26］Young E，Beardall J，Giordano M. Inorganic carbon acquisition by Dunaliella tertiolecta（Chlorophyta）involves external carbonic anhydrase and direct HCO3- utilization insensitive to the anion exchange inhibitor DIDS［J］. European Journal of Phycology，2001，36：81-88

［27］Nimer NA，IglesiasRodriguez MD，Merrett MJ. Bicarbonate utilization by marine phytoplankton species［J］. Journal of Phycology，1997，33：625-631

［28］Dason JS，Huertas IE，Colman B. Source of inorganic carbon for photosynthesis in two marine dinoflagellates［J］. Journal of Phycology，2004，40：285-292

［29］Gardner RD，Cooksey KE，Mus F，et al. Use of sodium bicarbonate to stimulate triacylglycerol accumulation in the chlorophyte Scenedesmus sp. and the diatom Phaeodactylum tricornutum［J］. Journal of Applied Phycology，2012，24：1311-1320

［30］Yeh KL，Chang JS，Chen WM. Effect of light supply and carbon source on cell growth and cellular composition of a newly isolated microalga Chlorella vulgaris ESP-31［J］. English Life Science，2010，10：201-208

［31］戴玉蓉，盧敬讓.NaHCO3在單胞藻藻種培養中的作用［J］.齊魯漁業，1997，14（5）：20-21

［32］Huertas IE，Colman B，Espie GS. Inorganic carbon acquisition and its energization in eustigmatophyte algae［J］. Functional Plant Biology，2002，29：271-277

［33］Chen CY，Durbin EG. Effects of pH on the growth and carbon uptake of marine phytoplankton［J］. Marine Ecology Progress Series，1994，109：83-94

［34］Huang XX，Huang ZZ，Wen W，et al. Effects of nitrogen supplementation of the culture medium on the growth，total lipid content and fatty acid profiles of three microalgae（Tetraselmis subcordiformis，Nannochloropsis oculata and Pavlova viridis）［J］. Journal of Applied Phycology，2013，25：129-137

［35］Zhu CJ，Lee YK，Chao TM. Effect of temperature and growth phase on lipid and biochemical composition of Isochrysis galbana TK1［J］. Journal of Applied Phycology，1997，9：451-457

［36］Harrington KJ. Chemical and physical properties of vegetable oil esters and their effect on diesel fuel performance［J］. Biomass，1986，9（86）：1-17

［37］梅帥，趙鳳敏，曹有福，等.三種小球藻生物柴油品質指標評價［J］.農業工程學報，2013（15）：229-235

［38］Knothe G，Matheaus AC，Ryan III TW. Cetane numbers of branched and straight-chain fatty esters determined in an ignition quality tester［J］. Fuel，2003，82（8）：971-975

Effects of NaHCO3and Culture Phase on Growth, Protein Content and Fatty Acid Composition of Isochrysis galbana

WANG Xing-yu1，HUANG Xu-xiong1，2，3*，YANG Bi-lian1

1. Key Laboratory of Genetic Resources for Freshwater Aquaculture andFisheries，Shanghai 201306，China
2. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture，Shanghai 201306，China
3. Aquatic Animal Genetic Breeding Center Collaborative Innovation Center in Shanghai（ZF1206），Shanghai 201306，China

Abstract：The growth，cellular protein content and fatty acid profile in micro-algae Isochrysis galbana were valuated when the culture was supplemented with 0，0.5，1.0，1.5 and 2.0 mg/mL NaHCO3respectively. Then the protein content and fatty acid profile in cell at different growth phase were also investigated when the culture medium was added with 1.5 mg/mL NaHCO3. The results indicated there were significant effects of NaHCO3supplementation on growth，cellular protein content and fatty acid profiles. The treatment supplemented with 1.5 mg/mL NaHCO3displayed the highest cell density and special growth rate. The cellular protein content decreased significantly along with the increasing supplementation of NaHCO3in culture medium. The monounsaturated fatty acids increased significantly while the polyunsaturated fatty acids decreased significantly along with the increase of NaHCO3supplementation. There were significant differences in cellular protein content and fatty acid profile among the cells which were at a different growth phase when the cells were cultured in the medium supplemented with 1.5 mg/mL NaHCO3. The saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids increased significantly while the polyunsaturated fatty acids decreased significantly along with the culture duration. Therefore it was suggested that NaHCO3supplementation in culture medium was helpful for improving the micro-algae quality for bio-diesel production.

Keywords：Isochrysis galbana；NaHCO3；growth；protein content；fatty acid

中圖法分類號：S985.4+9

文獻標識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）03-0345-08

收稿日期：2015-10-20修回日期：2015-11-03

基金項目：上海市科技興農項目（滬農科推字（2013）第2-1號；滬農科攻字（2015）第1-2號）

作者簡介：王星宇（1994-），男，陜西延安人，本科生，研究方向：生物技術與生物餌料. E-mail：robsten8@126.com