30個馬鈴薯卷葉病毒CP基因序列分析

韓樹鑫，張俊華*，白艷菊，*，張威，，高艷玲，，范國權，張抒，申宇

1.東北農業大學，黑龍江哈爾濱1500302.黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086

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30個馬鈴薯卷葉病毒CP基因序列分析

韓樹鑫1，張俊華1*，白艷菊1，2*，張威1，2，高艷玲1，2，范國權2，張抒2，申宇2

1.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030
2.黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086

摘要：通過對含有PLRV的不同樣品RT-PCR擴增，成功地克隆了PLRV CP基因，經比對樣品的CP基因序列，核酸一致率為99.55%，僅發現了來自于廣東的樣品與其它樣品有5個堿基的差異。試驗樣品與國內已報道的PLRV CP基因進行進化分析，不同地區的PLRVCP基因可分為A，B組，且有區域性特征。來自廣東、云南及貴州的樣品在兩組中均有分布，但來自于內蒙古的樣品僅聚類在A組。而中國樣品與其他國家PLRV CP基因相比較，經進化樹分組后，主要分為S1和S2兩組，其中S1組中，包含了所有來自于我國的樣品和絕大多數其它樣品，且無規律可循；而S2組中的樣品僅只來自于埃及和波蘭?？傮w上，PLRV CP序列的差異仍然較小，因此，目前PLRV病毒的種群基因較穩定。

關鍵詞：馬鈴薯；卷葉病毒；CP基因；序列分析

馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV），屬于黃癥病毒科（Luteoviridae）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus），主要侵染茄科植物，能夠引起馬鈴薯卷葉、黃化、矮縮、僵化及塊莖網狀壞死等病癥，導致產量和品質下降。PLRV是單分子正義ssRNA病毒，全基因組長610 Kb，其中第4個讀碼框（ORF3）是CP的編碼序列，長627 bp，編碼產物為23 kDa的多肽［1，2］。該病毒于1916年被發現，病毒主要集中于寄主體內的維管束中，且含量低［3］。PLRV在田間以蚜蟲持久性傳播，持毒時間久，傳播距離遠［4］。通常蚜蟲在馬鈴薯田中的密度比臨近作物高，在馬鈴薯生長期間蚜蟲密度逐漸增大，PLRV病毒感染率也隨之增加［5］。由于PLRV在中國馬鈴薯生產區普遍發生［6］，而病毒病防治沒有特效藥劑，一旦感病則難以控制，所以病毒檢測非常重要，通過檢測剔除感病植株或切斷傳播途徑防止擴散。

中國是一個幅員遼闊、地理氣候等環境復雜的國家。目前，馬鈴薯從南到北，從東到西，全國范圍內廣泛分布，PLRV在各地都有發生，且新的PLRV也會隨種子資源的引進而發生同步引進的風險。圍繞PLRV的CP基因進行的研究比較普遍，但都是以地區劃分，缺乏銜接和與國際上整體PLRV種群間的比對分析，而且，PLRV病毒是否隨環境和氣候的改變而有所不同尚無系統研究和闡述。PLRV的CP基因還是PLRV檢測單克隆抗體的重要來源。本研究的開展有利于了解PLRV病毒的變異、重組，可以進一步了解我國PLRV的種群構成，有助于了解病毒的發生、流行特點，并為在生產中PLRV的檢測鑒定、防治及其致病機理、抗病基因工程育種的研究提供理論支持和參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗使用的馬鈴薯材料來自于黑龍江省農科院植物脫毒苗木所，于2012～2014年采集，經ELISA檢測感染PLRV的馬鈴薯樣品30份（表1）。

表1　樣品來源Table 1 Sources of samples

1.2引物的設計與合成

根據已有的馬鈴薯卷葉病毒基因的保守序列，及常用于檢測Total RNA質量的內參基因NAD5的保守序列，本試驗共使用三對引物，其中PLRV-F/R用于鑒定馬鈴薯樣品是否感染PLRV病毒，NAD5-F/R用于鑒定RNA是否符合試驗要求。同時設計了引物CP-PLRV-F/R用于擴增PLRV的CP序列。引物由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。

表2　引物列表Table 2 The list of primers

1.3總RNA的提取

植株總RNA的提取按照Trizol（Invitrogen）試劑說明書步驟進行。提取試驗的所有離心操作均在4℃下完成，應用分光光度法測定RNA濃度及純度，用電泳法檢測RNA完整性。

1.4RT-PCR檢測及PLRV的CP序列擴增

1.4.1cDNA第一鏈的合成以感染PLRV的馬鈴薯葉片總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈，反應步驟為：在PCR管中加入模板RNA4 μL，Random primer 1 μL，用DEPC水補齊至10 μL。65℃加熱5 min。冰上冷卻2 min后像PCR管中加入5×Buffer 5 μL，dNTP 1.25 μL（10 mmol/L），RNasin 0.5 μL （40 U/uL），M-MLV1 μL（200 U/μL），用DEPC水補齊至25 μL。在PCR儀上按下列條件進行反轉錄反應：37℃1 h，70℃15 min（酶失活）后，冰上冷卻，-20℃保存備用。

1.4.2RNA質量和馬鈴薯PLRV病毒的雙重RT-PCR檢測以cDNA第一鏈為模板，使用引物NAD5-F/R 和PLRV-F/R進行雙重PCR擴增，使用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。雙重RT-PCR鑒定PLRV病毒及RNA質量的步驟為：在PCR管中加入制備的cDNA2 μL，dNTP 2 μL（2.5 mmol/L），rTaq 0.25 μL （5 U/μL），10×PCR Buffer 5 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.5 μL，用DEPC水定容到25 μL的反應體系。PCR擴增條件：94℃2 min預變性后進行35個循環（94℃變性20 s，55.5℃退火30 s，，72℃延伸30 s），72℃延伸5 min，4℃存放。

1.4.3CP基因的擴增PLRV的CP基因的擴增與馬鈴薯PLRV的RT-PCR檢測除退火溫度為60℃外，其余步驟相同，擴增完成后同樣使用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.5PCR產物測序及序列分析

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由華大基因進行測序，使用DNAMAN軟件對測序結果進行拼接后對比分析，并使用MAGA6軟件，通過最大相似法（Maximum Likeihood），在1000個重復下（Bootstrap trials）進行系統進化分析。

2　結果與分析

2.1雙重RT-PCR檢測結果

對經DAS-ELSIA的檢測受PLRV病毒侵染的30份樣品（表2）進行總RNA提取和雙重RT-PCR擴增檢測，結果顯示（圖1），可以擴增到2條不同的電泳條帶，條帶大小分別為336 bp及140 bp，片段大小與試驗設計相符，表明樣品中的總RNA含有PLRV病毒的RNA且RNA質量良好，進一步驗證了樣品感染了PLRV病毒。

2.2CP序列擴增結果

對篩選出的含PLRV病毒的樣品進行CP基因序列經RT-PCR擴增，得到一條長約630 bp的擴增產物，大小與引物設計相一致，且條帶單一，明亮。

2.3CP序列的測定與分析

圖3　檢測樣品的PLRV CP基因的核苷酸序列比對結果Fig.3 The contrast of PLRV CPgene alignment sequences of samples

PLRV病毒CP基因的PCR擴增產物經測序后，使用DNAMAN軟件進行比對，結果表明，PLRV 的CP序列全長共627個堿基，樣品序列間核酸一致率達到99.55%，說明此次進行序列擴增PLRV樣品間的序列差異不大，基本沒有發生的較多堿基參與重組及突變現象（圖3）。另外，在序列比對中可以看到，樣品間除了個別的堿基有不規律的改變，PLRV-12-10-12和RV2-RV8這些樣品，在CP基因序列中的第143、169、238、387、574位處堿基發生了有規律的發生改變。PLRV-12-10-12和RV2-RV8這些樣品的堿基與其它樣品相比，第143位處，T變為了C、第169位處，T變為C、第238位，A變為G、第387為，C變為T、第574位，A變為C。雖然，這些突變在整個基因上的分布距離較遠，并不能聚集成簇，且占整個基因序列的比例極小，但通過序列分析，我們還是能發現，這些樣品與其它樣品間，在序列上的差異是有規律可循的。第三，從樣品采集的區域來看，發生堿基突變的PLRV-12-10-12和RV2-RV8這些樣品的采集區域集中在廣東地區。而其它的樣品則來源于內蒙古、河南、甘肅等地。這也說明我國的PLRV的分布不但有其遺傳因素的影響，來自于地域的自然環境的影響也有，但很小。

2.4中國PLRV病毒CP基因系統進化分析

為進一步明確我國不同地區間PLRV病毒的種群狀態，使用MAGA 6.0軟件并選取本試驗樣品中有代表性的樣品與其它已報到的我國不同地區的CP序列（表3）進行系統進化比較分析（圖4）。試驗樣品與我國不同地區的CP序列遺傳進化分析表明，所有的序列可分為2組，我們將他們分別編為A組，B組（圖4），從這兩組樣品的來源看，雖然同源性很高，卻仍有區域性特征，來自廣東、云南及貴州的樣品在各組中均有分布，但來自于內蒙古自治區的樣品則未在B組中被發現。另外，A組中，所有樣品聚類為一個群組，內蒙古自治區的樣品占大多數，而B組中，聚類成兩個亞組，樣品主要來自于廣東、貴州、云南，地域間差異微小。

表3　國內已報道PLRV CP基因序列Table 3 PLRV CP gene sequences reported in China

2.5中國PLRV病毒CP基因序列與國外的比較

從國內樣品的系統進化分析出來的兩個組群中，以遺傳關系的遠近為標準選取其中有代表性的樣品17個與世界其它地區的PLRV的CP基因序列進行系統進化分析（圖5），在Gene Bank共查得國外序列49個（表4），分析結果表明，已報到的世界范圍的PLRV，其CP序列的整體同源性同樣較高，但仍有一定差異。經進化樹分組后，可主要分為S1和S2兩組，其中S1組中，包含了所有來自于我國的樣品和絕大多數其它樣品，且無規律可循，而S2組中的樣品則只來自于埃及和波蘭，由此，可說明目前世界范圍內PLRV的種群基因較穩定。

圖4　試驗樣品與國內樣品的CP核苷酸序列構建進化樹Fig.4Thephylogenetictreeof CPuncleotidesequences ofthe testsampleandothersin China

圖5　試驗樣品與各地樣品的PLRV核苷酸序列構建進化樹Fig.5 The phylogenetic tree of PLRV uncleotide sequences from thetestsamplesandothers

表4　各地的不同來源PLRV CP基因序列Table 4 PLRV CPgene sequences from different sources around world

3　討論

目前，馬鈴薯卷葉病毒是造成馬鈴薯減產和品質下降的主要病害之一，各地發生普遍且不同的地區由于生產條件及自然條件不同，導致植株癥狀也不盡相同，從而對生產造成了嚴重的危害［9］。隨著轉基因技術的不斷發展和完善，利用植物病毒保守區基因的siRNA進行轉基因育種，從而使品種對相應植物病毒的抗性增強［10］，由于馬鈴薯卷葉病毒CP序列的相對保守，所以人們對其的研究也隨之增多［11-13］。另外，由于在生產中對PLRV檢測的方法主要以血清學方法為主，而制備檢測所用的單克隆抗體大多數是以PLRV的CP蛋白為識別目標，所以一旦有部分PLRV的CP基因編碼發生變化，進而導致相應PLRV的CP蛋白發生變化，導致漏檢，則會對我們下一步的工作造成影響［14，15］。

本試驗對各地的受PLRV侵染的CP基因序列樣品進行了RT-PCR擴增和測序。試驗目的是檢測我國不同地區的馬鈴薯卷葉病毒是否存在有CP基因序列測序出現重組或突變的個體及群體，并通過與世界其它地區PLRV的CP基因進行比對分析，進而對我國PLRV種群的現狀進行分子生物學評價。結果表明本次擴增的樣品的CP基因全長627 bp。利用DNAMAN軟件對實驗樣品的CP基因序列進行分析，發現試驗樣品的CP序列間差異極小，核酸一致率達到99.55%，基因保守性高，這與大多數研究的結果相同［16］。但廣東地區的樣品與其它地區樣品CP基因經比對后，有5個位置的堿基發生了有規律的變化。這說明，雖然CP基因保守性高，可有規律的突變在不同地區的PLRV CP基因中還是會發生的。

通過MAGA6.0對實驗樣品CP序列與Genbank中已知來自于我國的所有PLRVCP基因序列進行進化分析，發現雖然我國國內PLRV差異極小，但仍可分為A，B兩組，其中A組中內蒙古自治區樣品占絕大多數，而B組中不含來自于內蒙古自治區的CP基因，另外，廣東、云南、貴州的樣品則在兩組中均有出現，這可能與該病毒受當地環境或氣候長期影響有關，也與馬鈴薯種植特點有關，廣東為馬鈴薯種薯輸入省份，PLRV可隨各地種薯到達此地，其基因型可能相對復雜；內蒙古、貴州、甘肅、云南為種薯輸出省份，且云南、貴州的種薯通常不會北調，適宜這個地區的種子資源一般也不適宜北方，因此，這個區域的PLRV病毒則不會遷移北方，而北方的PLRV病毒會隨種薯調運或種子資源到達南方，那么，B組中有一個亞組只有貴州和云南的樣品的情況就很容易理解了。

挑選有代表性中國PLRVCP基因序列與Genbank中已上傳的世界其它地區的基因進行進化分析，我國的PLRV與世界上大多數地區的樣品被分在了同一大組S1組內，而另外的一組S2組中，僅有來自于埃及和波蘭的樣品，埃及地理位置和氣候具有特殊性，其登錄號為GQ376025的PLRV與其他分離物同源性略遠也許反應出這一原因，但波蘭的樣品聚類到S2則沒有合適的解釋，尚需進一步研究。

本次比對的所有CP基因序列的時間跨度從1989年至今，雖然，時間跨度長達近30年，但作為極易發生突變的物種——病毒，卻未發現PLRVCP基因序列發生較大突變或重組，這說明我國PLRV種群與國外的PLRV同屬于一個來源，且在相當長的時間內，受自然環境和遺傳因素的雙重壓力下，其遺傳性狀還是很穩定的。這進一步的表明，PLRV的多面體分子結構與其它病毒相比是穩定的。PLRV CP基因間差異，只是由于不同地區的自然環境導致單個核酸位點改變。這些結論與馮光惠等、吳興全等、顏永杰等根據我國不同地區的PLRV CP基因與國內外其它PLRV CP基因進行分析后得出的結論是相同的，即不僅我國的PLRV CP基因具有高度的同源性及核酸一致率，且未發生改變其CP蛋白性狀的突變［17-19］。目前僅突尼斯發現了PLRV的變異株［20］，但變異部位在P0區，CP端無特殊變化。

4　結論

本研究通過測試樣品與國內為樣品CP序列的比對得到一系列對PLRV檢測、防治和抗病育種有指導性意義的結論，但由于可供分析的國內外樣品數量有限，不排除有PLRV的CP基因突變株的存在。

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Analysis on CPGene Sequences of Thirty Potato Leaf Roll Virus

HANShu-xin1，ZHANGJun-hua1*，BAIYan-ju1，2*，ZHANGWei1，2，GAOYan-ling1，2，FANGuo-quan2，ZHANGShu2，SHENYu2

1. Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China
2. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China

Abstract：We used RT-PCR to amplify the different samples with PLRV and successfully cloned PLRV CP gene by means of comparing CP gene sequence of samples to discover 99.55%of the nucleic acid concordance rate，there was only five bases difference between the sample from Guangdong and others. We had analyzed the test samples and other recorded PLRV CP genes in China and divided them from different districts into Group A，Group B. The results showed that samples from Guangdong，Yunnan and Guizhou distributed in two groups but only the samples from Inner Mongolia cluster in Group A. The PLRV CP genes from Chinese samples compared with other countries to be divided into Group S1 and Group S2. In Group S1，there were unordered samples from China and most of other countries；in Group S2，there were only samples from Egypt and Poland. In one word，there were a little difference in PLRV CP sequences so that at present the gene of the PLRV population was stable.

Keywords：Potato；potato leaf roll virus（PLRV）；CP gene；sequences analysis

中圖法分類號：S4325.32；Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）03-0353-06

收稿日期：2015-04-20修回日期：2015-08-20

基金項目：現代農業產業技術體系專項資金資助（CARS-10-P14）

作者簡介：韓樹鑫（1984-），男，在讀博士研究生，主要從事植物病理方向的研究. E-mail：pluto789@163.com

*通訊作者：Author for correspondence. E-mail：Podozjh@163.com；Yanjubai@163.com