四種果皮中橙皮苷含量的測定

曹峰

萊蕪市食品藥品檢驗檢測中心，山東萊蕪271100

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四種果皮中橙皮苷含量的測定

曹峰

萊蕪市食品藥品檢驗檢測中心，山東萊蕪271100

摘要：為建立一種測定橙皮、橘皮、柚皮及檸檬皮中橙皮苷含量的高效液相色譜法。以Symmertry Shield RP18柱為分離柱，甲醇-2.5%乙酸溶液（40：60 V：V）為流動相，柱溫30℃，紫外檢測器在波長283 nm條件下檢測，一次進樣7 min內完成分析過程。橙皮苷在2.0～100.0 mg/L范圍內有良好的線性關系（R=0.9999）；平均加標回收率為98.9%，檢出限為2.0×10-3g/kg；精密度實驗（n=6）表明，橙皮苷峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.05%。該方法簡便快捷，可準確測定四種果皮中橙皮苷的含量。

關鍵詞：高效液相色譜法；四種果皮；橙皮苷

橙皮苷（Hesperidin）是一種雙氫黃酮類糖苷［1］，為黃酮類化合物中最重要的一種。研究表明，橙皮苷具有抗氧化、抗過敏、抑菌消炎、抗病毒、抗癌、維持滲透壓、降低血壓、降低低密度膽固醇、調節免疫、改變體內酶活性、改善微循環等生理功能［2，3］，具有很高的藥用價值，是治療心血管疾病藥物的重要原料［4］。此外，橙皮苷還可作為天然抗氧化劑和食品添加劑的原料，在食品及保健品領域有著廣泛的用途［5］。

橙皮苷主要存在于柑橘類水果中，尤其是在柑、橘、甜橙和檸檬等的果皮中含量較多［1］，但除橘皮可作為中藥材陳皮外，橙皮、柚皮、檸檬皮等常作為廢棄物扔掉，從環境、經濟和資源利用角度都不盡科學合理。因此，準確測定橙皮、橘皮、柚皮及檸檬皮中橙皮苷含量，為橙皮苷提取原料的選擇提供理論依據，對充分利用四種果皮具有重要意義。目前橙皮苷的檢測方法主要有高效液相色譜法［6］、紫外分光光度法［7］、高效液相色譜-串聯質譜聯用法［8］，核磁共振氫譜法［9］等，其中高效液相色譜法具有靈敏度高、重現性好、操作簡便等優點，是最常用的測定方法之一。

為充分提取果皮中的橙皮苷，本實驗參考相關文獻［10-12］并加以改進，以甲醇作為提取液，超聲提取3次，大大提高了橙皮苷的提取率，并建立了一種準確、簡便、快速測定四種果皮中橙皮苷含量的高效液相色譜法，旨在為為橙皮、橘皮、柚皮、檸檬皮資源的充分利用提供理論支持。

1　材料與方法

1.1設備與材料

Waters e2695高效液相色譜儀（帶自動進樣器，Empower 3工作站），美國Waters公司；Waters 2489紫外/可見光檢測器，美國Waters公司；UV-9000S雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；JAC-300N超聲波振蕩器，濟寧市奧波超聲電氣有限公司；TGL-20M臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

橙皮苷標準品，美國ACROS公司；甲醇（色譜純）、冰乙酸（優級純），天津市科密歐化學試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.2色譜條件

色譜柱為Symmertry Shield RP18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm；美國Waters公司），流動相為甲醇-2.5%乙酸溶液（40：60 V：V），流速為1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30℃，紫外檢測器波長283 nm。以保留時間定性，峰面積定量。

1.3樣品處理

將干燥后的橙皮、橘皮、柚皮及檸檬皮四種果皮樣品粉碎，過60目篩，分別稱取樣品0.2 g（精確至0.001 g），放入250 mL具塞三角瓶中，加入50 mL甲醇，于超聲波振蕩器中超聲提取45 min（功率200 W，溫度50℃），然后以6000 r/min的轉速離心15 min，移取上清液于250 mL容量瓶中，剩余殘渣再超聲提取2次，每次20 mL甲醇，超聲提取10 min，合并提取液，用甲醇定容至250 mL，經0.22 μm濾膜過濾后待測。

1.4標準品溶液的配制

精確稱量橙皮苷標準品5.00 mg，用甲醇超聲溶解并定容至50 mL，即得100.0 mg/L橙皮苷標準品溶液，作為儲備液。

分別精確移取橙皮苷標準品儲備液0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL于5只10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L橙皮苷標準品溶液。

2　結果與分析

2.1色譜條件的優化

2.1.1檢測波長的選擇利用紫外可見分光光度計對橙皮苷標準品溶液在波長200～350 nm范圍內進行紫外掃描，結果見圖1所示。

圖1　橙皮苷的掃描光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of hesperidin

由圖1可以看出橙皮苷在波長283 nm左右有最大吸收，與《中國藥典》中藥材陳皮質量標準中橙皮苷含量測定的檢測波長一致，且在最大吸收波長條件下檢測干擾少，靈敏度高，因此本研究選擇283 nm作為檢測波長。

2.1.2流動相及洗脫條件的選擇參照相關文獻［13，14］，本研究對比了乙腈-0.5%磷酸、乙腈-0.5%乙酸、甲醇-2.5%乙酸溶液、甲醇-0.5%磷酸4種流動相體系，結果表明乙腈-0.5%磷酸、乙腈-0.5%乙酸、甲醇-2.5%乙酸溶液3種流動相體系的分離效果較好，由于甲醇毒性小于乙腈且乙酸腐蝕性要小于磷酸，因此本研究選擇甲醇-2.5%乙酸溶液為流動相。

將甲醇與2.5%乙酸溶液在體積比分別為10：90、20：80、30：70、40：60及50：50的條件下對橙皮苷標準品及4種果皮提取液進行等度洗脫，結果發現兩者體積比為20：80時橙皮苷在30 min內未能出峰，30：70時橙皮苷出峰時間在15 min左右，而體積比在40：60時橙皮苷5 min左右就能出峰，且峰形良好。盡管提高有機相甲醇的比例，橙皮苷的出峰時間能夠提前，但橙皮苷色譜峰與雜質峰不能很好分離，考慮到檢測效果，選擇甲醇與2.5%乙酸溶液體積比為40：60。

2.1.3柱溫及色譜條件的確定柱溫對色譜柱的分離效果有一定影響，隨著溫度升高，柱壓下降，被分析物質的保留時間縮短，由于橙皮苷耐熱性較好，考慮到分析效果及分析時間，選擇柱溫為30℃。

通過以上實驗，最終確定色譜條件為：流動相為甲醇-2.5%乙酸溶液（體積比40：60），流速為1 mL/min，進樣量20 μL，紫外檢測器波長283 nm，柱溫30℃。在此條件下橙皮苷標準物質及四種果皮樣品色譜圖見圖2所示。

圖2　橙皮苷標準物質及四種果皮色譜圖A：橙皮苷標準物質；B：橙皮；C：橘皮；D：柚皮；E：檸檬皮Fig.2 Chromatogram of hesperidin standard materials and four kinds of peels A：Hesperidin standard；B：Orange peel；C：Citrus peel；D：Pomelo peel；E：Lemon peel

2.2橙皮苷的線性和檢出限

在優化的色譜條件下，對1.4中配制的不同濃度的橙皮苷標準物質溶液進行測定，結果顯示在此范圍內濃度和峰面積之間有良好的線性關系。橙皮苷的標準曲線見圖3，回歸方程、相關系數（R）、檢出限（在優化的色譜條件下以3倍信噪比為檢出限）、相對標準偏差（RSD）見表1。

圖3　橙皮苷的標準曲線Fig.3 Standard curve of hesperidin

表1　回歸曲線的基本參數及檢出限Table 1 Fundamental parameters of regression equation and detection limit

2.3檢測方法的精密度實驗

將濃度為10.0 mg/L的橙皮苷標準品溶液進樣20 μL，連續重復6次，測其峰面積，結果見表2。

表2　精密度實驗結果（n=6）Table 2 Results of precision test（n=6）

由表2可以看出，連續6次測定的橙皮苷峰面積的RSD為0.05%，因此本方法精密度良好。

2.4樣品加標回收率的測定

以橙皮為樣品，按線性范圍加入一定量的橙皮苷標準物質，按照1.3中的方法處理后進行加標回收實驗，平行測定6次，結果見表3。

表3　加標回收實驗（n=6）Table 3 The recovery test（n=6）

從表中結果可以看出，在優化的分析條件下橙皮苷的平均加標回收率為98.9%，相對標準偏差（RSD）為1.58%，測定結果準確可靠，完全滿足樣品的檢測要求。

2.5樣品中橙皮苷含量的測定

將1.3項制備的橙皮、橘皮、柚皮及檸檬皮供試樣品溶液按1.2色譜條件平行測定6次，結果見表4。

表4　四種果皮中橙皮苷含量（n=6）Table 4 The hesperidin contents in four kinds of peels（n=6）

由表4可以看出，4種果皮中橘皮（蜜桔）的橙皮苷含量最高，為3.48 g/100 g，其次為橙皮（臍橙）2.42 g/100 g，檸檬皮（香檸檬）1.23 g/100 g，其中柚皮（紅心柚）中未檢出橙皮苷，與但俊峰［15］的研究結果相似。

3　結論

本方法采用甲醇為提取液，甲醇-2.5%乙酸溶液（體積比為40：60）為流動相，紫外檢測器波長為283 nm，橙皮苷在2.0～100.0 mg/L范圍內有良好的線性關系（R=0.9999）；平均加標回收率為98.9%，檢出限為2.0×10-3g/kg；精密度試驗顯示6次測定橙皮苷標準品，其峰面積的相對標準偏差為0.05%。研究結果表明該方法分離效果好、快速簡便、精密度好，可以準確測定4種果皮中橙皮苷的含量，適合檢測機構的日常檢測。

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Determination of Hesperidin Contents in Four Kinds of Peels

CAO Feng

Laiwu Food and Drug Inspection Center，Laiwu 271100，China

Abstract：In order to develop a method for determination of hesperidin contents in orange peel，citrus peel，pomelo peel and lemon peel by HPLC. Hesperidin was qualitatively analyzed through a Symmertry Shield RP18 column. The mobile phase was methanol-2.5%acetic acid（40：60 V：V）and the column temperature was 30℃. A UV detector detected at 283 nm and the separation was achieved within 7 min. The standard working curve of hesperidin had a good liner relation in the concentration ranging from 2.0 to 100.0 mg/L（R=0.9999）. The average recovery was 98.9%and detection limit was 2.0×10-3g/kg. The precision test（n=6）showed that the relative standard deviation（RSD）for the peak areas was 0.05%. This method was simple and rapid and could determine the content of hesperidin in four kinds of peels.

Keywords：HPLC；four kinds of peels；hesperidin

中圖法分類號：O657.7

文獻標識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）03-0404-04

收稿日期：2014-06-03修回日期：2014-06-30

作者簡介：曹峰（1978-），男，碩士，工程師，主要從事食品檢驗檢測工作. E-mail：caofeng3709@163.com