循環腫瘤DNA與腫瘤精準治療

高 芃，李金明

(北京醫院臨床檢驗中心，北京 100730)

循環腫瘤DNA與腫瘤精準治療

高 芃，李金明

(北京醫院臨床檢驗中心，北京 100730)

目前治療腫瘤的手段多種多樣，已經不完全局限于傳統的手術切除及放化療等，分子靶向治療藥物的普及使“精準醫學”正逐步被應用到臨床腫瘤領域。隨著基因組學及生物大分子技術的日漸成熟，腫瘤精準醫學將個體疾病的遺傳學信息、診斷、治療三者結合，使腫瘤的診治更具有針對性、靶向性和特異性。因此，找到一種可以實時監測腫瘤狀態的標志物至關重要。循環腫瘤DNA(circulating tumour DNA，ctDNA)是腫瘤細胞在壞死、凋亡后釋放的一種游離DNA，由于其在血液中循環，所以對ctDNA的檢測可以及時反映腫瘤狀態。目前ctDNA檢測已應用于腫瘤的早期診斷、靶向治療和預后判斷等方面，由于高度特異性及靈敏性的新技術不斷出現，檢測ctDNA可作為一種“液體活檢”，具有很好的臨床應用前景。

腫瘤；循環腫瘤DNA；液體活檢；靶向治療

腫瘤是嚴重危害人類生命健康的一類慢性疾病，隨著腫瘤分子生物學的發展，臨床上已達到對腫瘤進行基因水平上的診斷及靶向治療。目前，實體瘤的遺傳圖譜是從手術或活檢組織標本中取得。但是，組織活檢標本不能反映其異質性，且由于獲取標本采用侵入性手段，給患者帶來一定痛苦。因此，尋找可以替代腫瘤組織活檢標本并具有高度敏感性和特異性的腫瘤標志物具有十分重要的意義。近年來不斷有報道，血游離DNA在健康人的血液中含量極低，但當機體處于特殊疾病狀態(如腫瘤、炎癥疾病和組織創傷等)時[1]，其含量明顯上升，且在腫瘤患者中游離DNA還存在DNA完整性、微衛星變化、基因突變、DNA超甲基化及染色體基因重排等腫瘤特異性的改變[2]，同時由于檢測血液樣本具有容易獲取、快速簡便且無創傷等優點，因此，檢測腫瘤患者血中游離DNA可視為一種“液體活檢”。2015年，MIT Technology Review雜志將“液體活檢技術”評為2015年度十大突破技術之一，有力證明了液體活檢技術具有強大的發展潛力和前景。本文就游離DNA的來源、生物學特點、檢測方法及其在腫瘤治療及診斷中的臨床意義做一綜述。

1 血游離DNA、循環腫瘤DNA(ctDNA)的來源及生物學特點

血游離DNA又名循環DNA，是指血循環中具有DNA雙螺旋結構的核苷酸片段，分子量0.5～3 kb。在血液中，其一部分以游離形式存在，另一部分通過與蛋白質結合成復合物或附著在細胞表面[3]。1948年Mandel和Métais首次發現血中存在細胞外核苷酸[4]。在將純化后的游離DNA注于小鼠體內的試驗中，結果顯示血循環中的雙鏈DNA存在時間長于單鏈DNA，環狀病毒DNA存在時間長于線性DNA[5]。血游離DNA可由肝臟和腎臟清除，根據其片段大小及形態不同，其半衰期可從15分鐘到數小時。研究表明，正常人血游離DNA大多來源于血細胞，其含量極低，在100 μg/L之下，平均約為30 μg/L[6]，而腫瘤患者的外周血游離DNA主要來源于腫瘤細胞壞死凋亡后擴散，或增生活躍腫瘤細胞的釋放。腫瘤細胞在壞死、凋亡后釋放出可以在人體血液系統中不斷循環的腫瘤基因組游離DNA片段，稱為ctDNA[1]，其濃度可高達1000 μg/L，平均值為180 μg/L[7]。腫瘤負荷與ctDNA釋放的含量直接相關[8]。對于一個腫瘤負荷為100 g(3×1010個癌細胞)患者，每天約有3.3%的腫瘤細胞DNA進入血循環[9]，經低濃度的瓊脂糖凝膠電泳分析表明其片段大小在一般在70～200 bp，最大片段可接近21 kb[10]。腫瘤患者中ctDNA還會出現腫瘤特異性的改變：如DNA完整性的改變、癌基因或抑癌基因的突變、基因的甲基化異常、微衛星改變、線粒體DNA荷載水平改變以及染色體基因組重排等。見表1。

表1 血游離DNA與ctDNA之間生物學特點對比表

2 ctDNA的檢測

隨著對腫瘤認識的不斷深入，目前可在基因水平上進行腫瘤相關分析?，F臨床上使用石蠟包埋的組織切片獲取腫瘤相關基因信息，但隨著對腫瘤分析日益增多，組織活檢樣本出現了很大的局限性，如很多患者無法進行手術取樣，某些腫瘤解剖位置不便進行穿刺，穿刺本身帶來的臨床危險[11]及反復取材帶給患者巨大痛苦等。當然，組織樣本最大的局限性是腫瘤的高度異質性[12，13]，包括：不同患者間的異質性、原發灶內部異質性、原發灶與轉移灶之間的異質性以及不同轉移灶之間的異質性。攜帶高度異質性腫瘤組織樣本無法反映真實的疾病狀態，給臨床帶來了很大的干擾。與傳統的組織學樣本相比，檢測血中ctDNA具有巨大的優勢，見表2。隨著對ctDNA認識水平的不斷提高，ctDNA定性、定量分析對腫瘤患者具有重要的臨床意義。因此，ctDNA的標本采集要求與檢測手段不斷受到研究者的重視。

表2 組織活檢與液體活檢優缺點對比表

2.1 ctDNA的檢測樣本要求及提取過程 檢測ctDNA需要1 ml血清或3 ml血漿。處理血漿時，血液需放于含有EDTA的抗凝血劑中，細胞通過離心與上清液或血漿分離。血清在血液凝結后被收集，離心去細胞后與血清分離[14]。收集的血漿或血清用專用試劑盒提取ctDNA。但有文獻指出[15]，當比較血清和血漿時，雖然血清中DNA量較多、質較純，但是由于其很易降解，因此降低異?；驒z測的陽性率。并且當血液凝固時，血細胞裂解可向血清中釋放正常DNA，可能會對檢測結果進行干擾。因此，臨床上使用血漿作為檢測ctDNA的最佳取樣標本。

為了更加準確地測量ctDNA的含量、分析ctDNA中腫瘤特異性基因的改變，對其檢測樣本的采集與提取也有嚴格要求：采新鮮外周血8～10 ml，放入專用的含EDTAK3抗凝血劑和細胞防腐劑的ctDNA BCT管中，輕輕倒轉8～10次，保證其充分混合，因為混合不充分或不及時均可能影響檢測結果的準確性。在4～37 ℃常溫保存和運輸，禁止冷藏或冷凍保存[16]。

2.2 ctDNA的檢測方法 由于腫瘤分離出的DNA的質量和數量變化極大，因此需要高特異性和高靈敏性的方法檢測ctDNA。ctDNA的檢測范圍為0.01%～93%[17，18]。研究者使用許多不同的方法如：數字PCR，基于流式技術的磁珠乳液擴增方法(bead emulsion amplification magnetic，BEAMing)、實時熒光定量PCR及高通量測序(next generation sequencing，NGS)等來定性、定量檢測DNA的基因突變以確定ctDNA的存在。

數字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)是通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的DNA 模板，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。可以實現單分子DNA絕對定量[19]。dPCR在超過75%的胰腺癌、子宮癌、大腸癌等患者中使用數字PCR可檢測到ctDNA，在原發性腦癌、腎癌及前列腺癌中的檢出率約為50%。Beaming技術結合了數字PCR和流式細胞儀，每一類DNA分子都會專一地與磁性微珠相連接，通過流式細胞儀檢測每個磁珠的熒光標記來分析DNA分子之間的差異[20]。其用于檢測血液樣品中已知基因突變具有不錯的效果，即使在非常低的拷貝數亦是如此。它比大多數競爭技術更敏感，同時也可使拷貝數量化[21]。實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[22]。擴增受阻突變系統(amplification refractory mutation system，ARMS)是基于耐熱Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特點，若引物的3′端堿基與模板堿基不互補，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此，根據已知點突變設計出引物，其3′端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區分開[23]。

由于高通量測序技術的發展，一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定成為可能。近年來，已經有研究者采用NGS法檢測NSCLC血漿中的ctDNA，然而其敏感度低、檢測成本高以及對患者選擇性強，只適用于少數的患者[24]。由于對NGS法的不斷改進，基于NGS的新型ctDNA檢測方法越來越多。腫瘤個體化分析深度測序法(cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq)利用定制化的突變位點庫作為篩選器，對樣本進行靶向捕獲后再進行新一代測序，通過在不同級別的肺癌患者中驗證，檢測ctDNA的靈敏度更高，能檢測到低至0.019%的ctDNA水平，特異性可達到96%，突變檢出率為0.02%，可以得到滿意的檢測效果，與全外顯子測序相比經濟可行[25]。標記擴增深度測序技術(tagged-amplicon deep sequencing，TAM-Seq)具有兩步擴增[26]：預擴增時利用特異性引物進行15個循環的目標區域擴增，再利用通用不同特性的接頭標簽進行二次擴增，通過雙向重復測序提高了測序精度，其突變頻率檢出率可達2%，具有高度靈敏度和特異性且測序通量高，因此測序時間和成本顯著下降。見表3。

表3 ctDNA的檢測方法對比表

3 ctDNA在腫瘤精準治療中的意義

近年來，隨著對ctDNA研究的不斷深入，ctDNA的檢測對腫瘤具有越來越重要的意義。通過監測ctDNA含量的變化，可以對腫瘤高危人群進行早期篩選。通過對ctDNA水平變化分析，能夠獲得來自腫瘤病灶(原發灶和轉移灶)相關的基因改變信息，利用這些腫瘤特異性基因改變，可以實時監測腫瘤進展，指導靶向治療藥物，實時監測耐藥變化，監測腫瘤復發及評估預后等。

3.1 腫瘤早期篩查 ctDNA水平的升高對腫瘤高危人群的早期篩查和腫瘤早期診斷具有重要意義。Jahr[18]通過檢測結腸癌和健康人中的血清DNA水平和CEA 水平，表明結腸癌患者ctDNA水平比健康人明顯升高，并提示可將血清游離DNA 與CEA 進行聯合檢測，并將其作為早期結腸癌篩查指標。Toth 等進一步將ctDNA 甲基化指標應用于結直腸癌的早期篩查[33]。Chan等[34]的研究結果也說明肺癌患者與健康人的ctDNA含量之間存在顯著性差異，檢測ctDNA水平可用于肺癌的早期篩查。

3.2 靶向治療藥物選擇 檢測ctDNA的目的是檢測腫瘤基因中特定位置的基因缺陷，并針對此種基因改變指導臨床對晚期腫瘤患者靶向治療藥物的選擇。檢測腫瘤患者ctDNA中腫瘤特異性基因發現，攜帶EGFR激活突變的患者經表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKIs)治療較常規化療具有更高的有效應答率(有效率可達到60%～72%)和更長的PFS[35]，其中攜帶EGFR 19外顯子缺失的患者PFS延長的最為明顯[36]。因此，對于EGFR突變型患者應將EGFR-TKIs作為一線治療藥物[37]。Allegra等[38]指出用抗EGFR抗體藥物治療轉移性結直腸癌時，患者要進行腫瘤基因型測試，當檢測出KRAS12或13號密碼子基因突變時，應避免使用抗EGFR抗體對其進行治療，選用EGFR單抗(西妥昔單抗或帕尼單抗)對其進行治療有效。Shaw等指出非小細胞肺癌中ALK重排陽性的患者對ALK激酶抑制劑敏感，可以選用克里唑替尼治療[39]，總緩解率可達65.7%，治療組肺癌相關癥狀顯著改善[40]。具有BRAF突變的黑色素瘤患者中，應用威羅菲尼可以延長其生存期[41]。見表4。

表4 腫瘤相關基因改變與靶向治療藥物

3.3 靶向治療耐藥實時監測 盡管靶向治療藥物為針對特定類型基因改變的腫瘤治療帶來里程碑式的意義，但近年來很多文獻表明患者會出現繼發性耐藥現象。通過監測ctDNA中腫瘤特異性基因的改變，可以對耐藥情況進行實時評估。Yun等[45]指出晚期非小細胞肺癌患者中出現EGFR耐藥突變T790 M通過其激酶結構域增加與ATP活性對吉非替尼產生耐藥性。Shi[46]通過對黑色素瘤的全基因組測序確定BRAFV600E擴增對BRAF抑制劑威羅菲尼產生繼發性耐藥，這種耐藥性的產生可能與受體酪氨酸激酶或N-RAS基因上調有關[47]。見表5。

表5 針對靶向治療產生的獲得性耐藥突變

3.4 腫瘤微小殘留病灶導致腫瘤復發的監測 ctDNA可作為腫瘤切除術后微小殘留的潛在標志物并可能確定患者是否復發。術后或經治療后ctDNA水平與術前無明顯變化或降低不明顯，提示患者體內含有腫瘤微小殘留病灶，可導致復發。用切除后的腫瘤組織確定針對每個患者自身的基因突變譜并做成針對每位患者的突變特異性探針，用于檢測并定量切除術后患者體內的ctDNA，隨訪2～5年，用ctDNA含量衡量患者在術后微小殘留病灶的存在，其檢測具有極高敏感性[52]。經手術切除后的食管癌患者，定量檢測ctDNA水平降低至正常人水平，但隨訪12個月后，2例血清DNA水平持續升高、4例血清DNA下降后再次升高者復查時出現明顯復發、轉移[53]。

另外，術后突變DNA的出現與腫瘤復發間存在很強的關聯性。在腸癌和卵巢癌完全切除術后的骨轉移患者的復發轉移原因是由于原發性卵巢癌中R273 h TP53突變的存在[54]。術后大腸癌患者中檢測腫瘤特異性突變，如TP53、KRAS等，可以確定疾病的復發率，其靈敏度和準確度高達100%[55]。有研究指出，在乳腺癌、肺癌及口腔鱗狀細胞癌中，疾病復發和特定腫瘤畸變(如KRAS、APC、TP53突變)中有一致性關系[56～58]。

3.5 腫瘤實時治療監測與預后評估 ctDNA 能實時顯示腫瘤患者體內腫瘤負荷的動態信息，可用于觀察治療效果，為評價療效、預后提供實驗依據。經手術治療后的乳腺癌患者血液中ctDNA含量顯著降低[59]，且經一段時間監測ctDNA水平，無上升趨勢，表明經手術治療后預后良好。在18例結直腸癌患者[52]中，第一次手術進行局部切除時，檢測ctDNA含量并沒有降低，第二次手術完全切除時，ctDNA含量降低明顯。另外，還可通過定量檢測增加的基因拷貝數評估特定的基因擴增預測療效，如檢測肺癌中的MET擴增可以預測肺癌患者對抗EGFR抗體的治療效果[60]。在轉移性結直腸癌患者中使用定量PCR檢測ctDNA中KRAS突變水平，低水平的KRAS突變說明使用第三代西妥昔單抗和伊立替康治療后可以穩定疾病狀態[61]。高濃度血漿KRAS和BRAF突變提示結直腸癌靶向治療后預后不良。

4 展望

隨著分子生物學技術的不斷發展與改進，對ctDNA的檢測水平也不斷提高，其檢測方法具有高度特異性及靈敏性，可作為一種有效的非侵入式腫瘤診斷方式。通過對腫瘤患者與健康個體ctDNA的差異，可以評估腫瘤的分子異質性，為腫瘤患者確定靶向治療藥物，評價藥物療效，檢測腫瘤發展進程等。但是同時，我們意識到ctDNA還存在一定的改善空間，對于ctDNA檢測水平的標準化方面需要做出努力。隨著人們對腫瘤基因突變的深入研究，腫瘤特異性基因突變檢測在臨床腫瘤應用檢測上逐步普及，而伴隨近年來NGS的發展，為 ctDNA基因突變 NGS檢測提供了條件。但經文獻查閱后發現，現尚無用于NGS的ctDNA質控品，故急需制備ctDNA質控品，將此ctDNA基因突變質控品應用于全國各級醫院以進行高通量測序的質量評價，以達到對于ctDNA檢測水平進行標準化的目的。

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Circulating tumor DNA and tumor precision treatment

GAO Peng，LI Jin-ming

(Clinical Laboratory Center，Beijing Hospital，Beijing 100730，China)

LIJin-ming

Up to now，there is a variety of treatments for tumor in addition to traditional surgical resection，radiotherapy and chemotherapy.The precision medicine based upon molecular targeted-therapy drugs has been gradually applied in clinical oncology.With gradually mature of genomics and biological macromolecules technology，tumor precision medicine that combines genetic information，diagnosis and treatment in individual disease makes tumor diagnosis and treatment more pertinent，targeted，and specific.Therefore，it is of crucial importance to find a marker which monitors the state of tumor in real time.Circulating tumor DNA (ctDNA)，a kind of cell-free DNA，is released after tumor cell necrosis or apoptosis.Since they circulate，detection of ctDNA may timely reflect the state of tumor.Currently ctDNA detection has been applied in early diagnosis，targeted therapy and prognosis of tumors.Due to the new technology with high specificity and sensitivity are emerging，detecting ctDNA，as a kind of “liquid biopsy”，has great clinical application prospects.

Tumor；Circulating tumor DNA；Liquid biopsy；Targeted-therapy

李金明，男，研究員，博士，博士研究生導師。中國計量測試學會國家標準物質委員會委員，中國輸血協會專家委員會成員，中華醫學會檢驗分會傳染病學組和免疫學組專家委員會委員。研究方向：臨床分子診斷方法及標準化。

R73-36

A

1672-6170(2016)03-0001-06

2016-04-05)