不同頻率超聲聯(lián)合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對(duì)微循環(huán)功能變化的實(shí)驗(yàn)研究

阿麗米娜·阿文，關(guān)麗娜，虎曉梅，穆玉明(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830054)

不同頻率超聲聯(lián)合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對(duì)微循環(huán)功能變化的實(shí)驗(yàn)研究

阿麗米娜·阿文，關(guān)麗娜，虎曉梅，穆玉明
(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的 觀察不同頻率超聲聯(lián)合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對(duì)微循環(huán)功能的影響。方法 18只新西蘭大白兔單側(cè)股動(dòng)脈制成富含血小板的混合性血栓模型，分為A、B、C3組各6只。均通過(guò)靶向微泡攜帶尿激酶在超聲照射30 min下輔助溶栓，其中A組超聲頻率1.6 kHz，B組2.2 kHz，C組2.8 kHz。應(yīng)用脈沖多普勒血流儀持續(xù)監(jiān)測(cè)血流流速，對(duì)血流量變化特點(diǎn)進(jìn)行分析，并對(duì)各組脛前肌行HE染色，比較不同頻率超聲的溶栓作用及對(duì)微循環(huán)功能變化的影響。結(jié)果 溶栓后120 min時(shí)，三組血流量變化比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，其中B組與A、C組比較實(shí)現(xiàn)了完全再通。A、C組均有未溶通或者微栓塞情況發(fā)生。經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)C組微循環(huán)末端有微小栓子，成分為由嗜酸性同質(zhì)性纖維素構(gòu)成，鏡下呈粉紅色。結(jié)論 超聲頻率2.2 MHz的條件下溶栓可以實(shí)現(xiàn)血栓的完全溶解，遠(yuǎn)端未見(jiàn)微栓子形成，栓子處于完全溶解狀態(tài)。

超聲；靶向微泡；溶栓；微循環(huán)；微栓塞

血栓形成和血栓栓塞后斑塊的破裂產(chǎn)生的碎片及微循環(huán)栓塞是任何一個(gè)血管手術(shù)術(shù)后有可能發(fā)生的一種并發(fā)癥，靜脈使用溶栓藥物的副作用主要是引起出血，其操作復(fù)雜、有創(chuàng)、易引發(fā)血管壁損傷或發(fā)生遠(yuǎn)端小血管栓塞的缺點(diǎn)，而體表超聲助溶不但能有效溶解血栓并且能夠使溶栓更加徹底，減少微循環(huán)栓塞的發(fā)生[1]。有研究報(bào)道，在目前先進(jìn)的支架及手術(shù)技術(shù)基礎(chǔ)上，栓塞率有所下降，微循環(huán)栓塞這種并發(fā)癥的死亡率由過(guò)去的4%～17%下降到了0.9%，因此如何減少微循環(huán)再栓塞無(wú)疑對(duì)治療血管性疾病起到重要作用[2]。既往研究結(jié)果顯示，應(yīng)用診斷超聲聯(lián)合靶向微泡攜帶尿激酶可以完全溶解股動(dòng)脈內(nèi)血栓[3]，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在實(shí)現(xiàn)了靶向血管內(nèi)血栓的有效溶解后，其末端的分支小血管出現(xiàn)了不同程度的再閉塞。因此，為進(jìn)一步研究其可能的原因，本研究通過(guò)選取不同超聲頻率聯(lián)合靶向微泡、尿激酶對(duì)兔股動(dòng)脈血栓進(jìn)行溶栓，探討不同頻率超聲溶栓后對(duì)微循環(huán)功能及微血栓形成的影響因素與意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備 18只新西蘭大白兔，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量1.8～2.8 kg，戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)麻醉，建立靜脈通道，仰臥位固定，腹股溝區(qū)脫毛，備皮，鈍性分離組織，分離股動(dòng)脈，結(jié)扎其相應(yīng)的深支和淺支。在該段股動(dòng)脈后壁放置大小為2.5 cm×2.5 cm 的橡膠薄膜，以保護(hù)動(dòng)脈周圍組織。在橡膠薄膜與股動(dòng)脈后壁放置一大小約0.5 cm×0.5 cm的浸有15%三氯化鐵溶液濾紙片將股動(dòng)脈環(huán)繞包裹，接觸面約為股動(dòng)脈周徑的3/4，待血流穩(wěn)定后，將股動(dòng)脈的遠(yuǎn)端用動(dòng)脈夾夾閉，7～8 min后取出動(dòng)脈夾，約20 min后取出濾紙片，用生理鹽水沖洗局部組織。所有動(dòng)物的處置均經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意(批件號(hào):20140403003)并按照相關(guān)規(guī)定處理。血栓模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn):①在30 min內(nèi)形成完全閉塞性血栓；②脈沖多普勒流儀血流量<0.05 ml/min；③二維和彩色多普勒超聲顯示閉塞性血栓；④經(jīng)HE染色證實(shí)為以血小板為主的混合件混合性血栓。以上標(biāo)準(zhǔn)如有1項(xiàng)不符合即為陰性結(jié)果。終止實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):自制作模型開(kāi)始觀察，總觀察時(shí)間120 min后終止實(shí)驗(yàn)[4]。

1.2 方法 將0.3 ml的TagestarSA超聲微泡與生物素化尿激酶(3 ml)及生物素化RGDS(3 ml)三者混勻，于室溫條件下孵育20分鐘，期間不斷輕微震蕩。待血栓形成后，經(jīng)耳緣靜脈通道緩慢注射。將LA523探頭置于血栓處，選擇爆破條件，待微泡到達(dá)血栓處，曝破約10 min，待股動(dòng)脈內(nèi)完全看不到造影劑即可停止爆破。使用LA240探頭，頻率1～4 MHz，照射血栓處30 min，觀察兩小時(shí)。將脈沖多普勒血流計(jì)的血流量恢復(fù)正常基礎(chǔ)血流四分之三以上定義為完全溶通，進(jìn)一步用二維和彩色多普勒超聲加以確定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻結(jié)扎遠(yuǎn)、近端血管，取出血管后，予過(guò)量麻醉藥處死動(dòng)物，切開(kāi)兔前肢小腿前側(cè)皮膚，鈍性分離筋膜組織，取脛前肌組織2 cm×1.5 cm，厚度為0.2 cm，標(biāo)本用4%福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，HE染色，觀察組織末端血管內(nèi)有無(wú)微血栓存在。

1.3 溶栓療效評(píng)價(jià)指標(biāo) 血管再通率: CDFI或血管造影進(jìn)行評(píng)價(jià)，以血管再通(達(dá)I級(jí):僅見(jiàn)細(xì)窄血流通過(guò))為標(biāo)準(zhǔn)[5]，判斷各組溶栓治療后血管的再通率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血流量的比較 不同時(shí)間段比較三組血流量變化情況，溶栓后120 min時(shí)，三組血流量變化比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，其中B組與A、C組比較實(shí)現(xiàn)了完全再通。見(jiàn)表1。

表1 不同超聲頻率下溶栓后120 min內(nèi)股動(dòng)脈血流量情況 (ml/min)

2.2 三組溶栓后血管的溶通情況及發(fā)生微栓塞的情況 根據(jù)CDFI血流頻譜觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果:三組溶栓后血管的溶通情況及發(fā)生微栓塞的情況:A組溶栓后血管部分未溶通，但未發(fā)生微栓塞；B組溶栓后血管均完全被溶通，沒(méi)有發(fā)生微栓塞；C組溶栓后有部分血管未溶通，發(fā)生了微栓塞。見(jiàn)表2。

2.3 各組超聲檢查結(jié)果 觀察不同條件下溶栓后血管溶通的情況溶通組:CDFI可見(jiàn)血流通過(guò)，未通組:CDFI未見(jiàn)血流通過(guò)。見(jiàn)圖1。

表2 不同超聲頻率下溶栓后血管溶通情況及發(fā)生微栓塞的情況

2.4 溶栓后兔脛前肌鏡下表現(xiàn) 18只動(dòng)物中14只血管內(nèi)血栓均完全溶解，4只未溶通。其中的1只出現(xiàn)了微循環(huán)再栓塞，光鏡下可見(jiàn)組織存在較明顯的瘀血和出血，白細(xì)胞聚集，組織呈蠟樣變性，提示骨骼肌壞死，微血管中由血小板纖維素和/或紅細(xì)胞組成，HE 染色呈粉紅色，證明微血栓形成。見(jiàn)圖2。

圖1 靶向微泡、尿激酶溶栓后血管再通的超聲及造影圖像 a:溶通組超聲下CDFI血流通過(guò)； b:未通組超聲下CDFI未見(jiàn)血流通過(guò)；c:溶通組造影可見(jiàn)造影劑顯影；d:未通組造影下造影劑未顯影

圖2 溶栓后脛前肌組織血管鏡下表現(xiàn) a:溶通組未發(fā)生微栓塞；b:纖維素及血小板組成的粉紅色血栓，略透明，箭頭所指為微血栓形成 (HE染色，×400)

3 討論

溶栓后微循環(huán)產(chǎn)生的碎片導(dǎo)致微循環(huán)栓塞，是溶栓治療最主要最嚴(yán)重的并發(fā)癥。本研究也證實(shí)，應(yīng)用不同超聲頻率聯(lián)合靶向微泡、尿激酶溶栓，雖然可以溶解血栓，但在末端分支小血管內(nèi)也可能出現(xiàn)小的碎片。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)微小栓子對(duì)減少微循環(huán)栓塞有重要意義。

通過(guò)超聲聯(lián)合微泡溶栓可能會(huì)使血栓破碎成小塊，但如果碎片大于下游毛細(xì)血管的直徑，這就會(huì)增加二次栓塞的風(fēng)險(xiǎn)[6，7]，研究發(fā)現(xiàn)溶栓后可能存在有大小約30～150 μm的游離血栓隨著大栓子脫落至管壁，繼而隨血液循環(huán)流動(dòng)至血管的細(xì)小分支導(dǎo)致微循環(huán)末端的再次栓塞[8，9]。這種小的栓塞結(jié)構(gòu)經(jīng)病理HE染色鏡下可見(jiàn)其內(nèi)部為團(tuán)塊狀的纖維蛋白結(jié)構(gòu)，觀察其周圍發(fā)現(xiàn)一些散在的紅色顆粒，考慮可能為沉淀的紅細(xì)胞，相比這種較小的栓子，當(dāng)血栓直徑小于150 μm時(shí)，血管內(nèi)可見(jiàn)有纖維素和紅細(xì)胞組成的粉紅色物質(zhì)，于之前看到的單純的紅細(xì)胞聚集形成的血栓不同，在病理HE染色時(shí)發(fā)現(xiàn)此時(shí)鏡下的細(xì)胞呈粉紅色，這種粉紅色的物質(zhì)為微血栓。

血凝塊碎片的大小在很大程度上取決于超聲照射強(qiáng)度[10，11]。研究表明超聲可有效促進(jìn)血栓溶解，當(dāng)超聲與溶栓藥物聯(lián)合溶栓時(shí)，可增加溶栓藥物的療效，使溶栓時(shí)間由3 h縮短至30 min[12]。另外，體外溶栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高強(qiáng)度超聲在脈沖模式下會(huì)誘發(fā)血凝塊溶解，這種技術(shù)取決于空化效應(yīng)和組織使用聚焦超聲波的頻率，由于脈沖時(shí)間短(<50個(gè)周期)、壓力高(>6 MPa)，相對(duì)于非線性脈沖空化作用低(0.1%～5%)，可在較短的時(shí)間內(nèi)分離出組織碎片。在血管溶栓治療的應(yīng)用中，多普勒超聲可有效反饋溶栓情況，5 MHz超聲診斷儀被用于監(jiān)測(cè)與治療血栓疾病，若在超聲溶栓的過(guò)程中，不斷增加頻率的范圍，首先出現(xiàn)的不良反應(yīng)為對(duì)機(jī)體有傷害作用，而且溶栓效果也并沒(méi)有較低頻率溶栓的結(jié)果理想，使用頻率較低的超聲具有通過(guò)體積較大的聲波作用來(lái)改進(jìn)穿透力與定位的優(yōu)點(diǎn)[13]。

研究表明[14]，超聲頻率2.2 kHz，超聲照射時(shí)間30 min，尿激酶劑量為3 mg時(shí)，將溶栓時(shí)間控制在10～60 min，隨超聲照射時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲溶栓效果越明顯。因此本實(shí)驗(yàn)依據(jù)要求將超聲照射血栓處的時(shí)間控制在30 min，我們既往的研究中[15]，由于使尿激酶有了靶向性，成功地降低了尿激酶的劑量(3 mg)，雖然實(shí)現(xiàn)了靶向血栓的有效溶解，但可能也存在一部分的尿激酶在血液中被中和后失活，進(jìn)而導(dǎo)致血液中尿激酶濃度減低，血栓的溶解片段過(guò)大，致微循環(huán)的再栓塞，因此藥物尿激酶的適量濃度也將影響血栓片段大小。不但實(shí)現(xiàn)了血管的溶通，并且沒(méi)有發(fā)生碎片，病理證實(shí)無(wú)微栓塞發(fā)生。而其他兩組，均有血管未通或(和)微栓塞發(fā)生，考慮其可能的原因是由于超聲在助溶的同時(shí)，可能會(huì)對(duì)遠(yuǎn)端小血管產(chǎn)生一定影響，造成血栓溶解片段過(guò)大，隨微循環(huán)在末端分支小血管產(chǎn)生微小的碎片，因此選取適當(dāng)?shù)某曨l率對(duì)減少微循環(huán)的栓塞有一定的作用。

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The changes of microcirculation function after in vivo thrombolysis by using targeted microbubbles with urokinase under different ultrasound frequency

ALIMINAA-Wen，GUANLi-na,HUXiao-mei,MUYu-ming
(DepartmentofEchocardiography，TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

MUYu-ming

Objective Objective To observes the effect of targeted microbubbles with urokinase under different ultrasound frequency on the microcirculation function after in vivo thrombolysis. Methods Eighteen New Zealand white rabbits were divided into A, B and C groups, 6 in each group after establishing a mixed thrombus model richer with platelets in unilateral femoral artery. Auxiliary thrombolysis was performed by using the target microbubbles with urokinase under ultrasound for 30 min, in which the group A

ultrasonic frequency was 1.6 MHz, the group B 2.2 MHz and the group C 2.8 MHz. Blood flow velocity was monitored by using a pulse Doppler blood flow meter and blood flow changes were analyzed. Meanwhile, samples of tibialis anterior muscles were stained by HE and the effects of thrombolysis under different ultrasonic frequency on microcirculation function were compared. Results After 120 min of thrombolysis, blood flow changes were significantly different among the three groups (P< 0.05), in which the group B achieved complete recanalization. There was incomplete recanalization or microemboli in another two groups. The HE staining showed that there was a small dose of microembolism composed of eosinophilic homogeneity of cellulose with pink color under microscopy. Conclusion The ultrasonic frequency 2.2 MHz, irradiation time 30 min, and urokinase of 3 mg thrombolysis can completely dissolve thrombus and can effectively prevent the microembolus formation.

Ultrasound； Targeted microbubble； Thrombolysis； Microcirculation； Micro embolism

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81301230)

穆玉明，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。中華醫(yī)學(xué)會(huì)超聲醫(yī)學(xué)分會(huì)常委，中華醫(yī)學(xué)會(huì)分會(huì)第七屆委員會(huì)淺表組織和血管超聲學(xué)組副組長(zhǎng)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)超聲醫(yī)學(xué)分會(huì)第八屆超聲心動(dòng)圖學(xué)組副組長(zhǎng)，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)超聲醫(yī)師分會(huì)常務(wù)委員，中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)常務(wù)理事，中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)超聲心動(dòng)圖專業(yè)委員會(huì)副主任委員，中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)研究會(huì)超聲分會(huì)常務(wù)委員，新疆超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)會(huì)長(zhǎng)，新疆醫(yī)學(xué)會(huì)超聲專業(yè)委員會(huì)主任委員。研究方向:心血管超聲。

540.4+5

A

1672-6170(2016)05-0015-04

2016-07-20)