MiR-125a誘導表達與順鉑抵抗的鼻咽癌細胞株凋亡相關性的研究

胡瓊英，艾承錦，張 爽，熊大千，江澤友，趙梓亦，張朝明(1.成都中醫藥大學附屬醫院.檢驗科；.科研部中心實驗室，四川 成都 610071)

MiR-125a誘導表達與順鉑抵抗的鼻咽癌細胞株凋亡相關性的研究

胡瓊英a，艾承錦a，張 爽a，熊大千a，江澤友a，趙梓亦b，張朝明a
(1.成都中醫藥大學附屬醫院a.檢驗科；b.科研部中心實驗室，四川 成都 610071)

目的 探討順鉑抵抗的鼻咽癌細胞株TW03微小RNA-miR-125a表達情況，為順鉑治療鼻咽癌的耐藥性尋找新的分子靶點和標志物。方法 建立順鉑抵抗的鼻咽癌細胞株TW03 細胞模型(TW03/DDP)，提取細胞中的總RNA，實時熒光定量聚合酶鏈反應(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)分析該細胞株中miR-125a表達情況，過表達miR-125a和anti-miR-125a后，檢測TW03細胞的凋亡和增殖情況。結果 順鉑抵抗的鼻咽癌細胞株中miR-125a的表達增高，后者可抑制順鉑抵抗的鼻咽癌細胞株凋亡。結論 順鉑抵抗的鼻咽癌細胞株誘導表達miR-125a可抑制鼻咽癌細胞株凋亡。

鼻咽癌；順鉑抵抗； miR-125a；凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是東南亞及我國東南地區好發的惡性腫瘤之一，在我國發病呈南高北低趨勢，發病率為20/10萬～30/10萬，而在歐美的發病率<1/10萬，發病有明顯的種族、地區和家族聚集現象，以青壯年男性為主[1]。鼻咽癌的治療以放療為主，但約有30%的放療患者預后較差，臨床上常常使用順鉑進行化療，促進鼻咽癌細胞的凋亡[2]。然而，順鉑化療的突出問題是產生藥物耐性，即順鉑抵抗，制約了鼻咽癌化療的療效[3]。探討順鉑抵抗的下游機制，是研究順鉑耐藥機制的關鍵。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的小非編碼RNA分子，可以調控真核細胞的基因表達、增殖、分化、凋亡等一系列生物學行為[4，5]。據報道，miR-125a與腫瘤細胞的分化、遷移和侵襲等生物學行為密切相關，其功能的實現主要通過翻譯后調控靶基因如ERBB2/3、BAK1和p53來實現，而后者是調控鼻咽癌細胞凋亡的靶基因。本研究進一步研究順鉑耐藥誘導的miR-125a表達情況及其調控鼻咽癌細胞凋亡和增殖的影響，探索順鉑抵抗的下游分子機制，以期為鼻咽癌的化療應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和處理 鼻咽癌細胞株TW03由美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)提供，順鉑耐藥的TW03耐藥株(TW03/DDP)的獲取是將TW03細胞與含順鉑(300 nM)DMEM培養基(Gibco Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)共孵育3周篩選而來，最終TW03耐藥株的順鉑篩選濃度穩定為10 μM。

1.2 轉染 將TW03細胞接種于12孔板，每孔密度為5×105個，轉染采用脂質體2000 (Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)，與miRNA共孵育48小時，轉染后的TW03細胞用冰磷酸鹽緩沖液沖洗，收集細胞，待分析。miR-125a的mirVana miRNA mimic批號為MC12378，miR-125a的mirVana?miRNA inhibitor批號為12378，均購自Life Technologies (Carlsbad，CA，USA)公司，使用濃度為5 nM。

1.3 提取RNA和RT-qPCR分析miRNAs 使用Trizol (Life Technologies)試劑盒提取培養細胞的總RNA，提取RNA的濃度通過測量在260 nm處的吸光度值分析待用。實時RT-PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒miScript SYBR-Green PCR Kit(Qiagen，Mississauga，ON，Canada)分析提取的RNA。miR-125a的引物和內部質控U6 snRNA購自Qiagen。

1.4 CCK8試劑盒分析TW03細胞凋亡情況 轉染后的TW03細胞接種于96孔板，每孔密度為2.5×104個，加入混有DDP (1～15 μM)的培養基，共孵育24、48 和 72小時，然后加入CCK8試劑(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，每孔10 μl，37 ℃孵育4小時，在450 nm和590 nm波長檢測吸光度。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株(TW03/DDP)對順鉑治療的反應性及has-miR-125a表達 順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株相對于正常TW03細胞株而言，隨著順鉑用藥濃度的增加，對癌細胞的活性抑制作用無明顯變化(圖1a)。進一步檢測miR-125a在順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株和正常TW03細胞株兩組中的表達水平，發現其在順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株中高表達(圖1b)。

2.2 順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株轉染miR-125a拮抗基因(miR-125a-ASOs)后對順鉑的反應性 為了進一步確定miR-125a對順鉑抵抗的誘導作用，拮抗順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株中miR-125a(has-miR-125a-ASOs)，發現轉染miR-125a-ASOs后TW03細胞株對順鉑用藥濃度的反應更為敏感，隨著順鉑濃度的增加，TW03癌細胞的活性抑制作用增強(圖2)。

圖1 順鉑抵抗的確定及miR-125a的表達情況 a:順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株(TW03/DDDP)和普通鼻咽癌TW03細胞株對順鉑濃度變化的反應情況；b:RT-PCR檢測順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株(TW03/DDDP)和普通鼻咽癌TW03細胞株中miR-125a的表達情況。

圖2 過表達miR-125a-ASOs后順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株對順鉑的反應情況

2.3 過表達miR-125a可誘導鼻咽癌TW03細胞株的順鉑抵抗作用 為了闡明miR-125a與順鉑抵抗的關系，過表達miR-125a(miR-125a mimic)，發現與未治療組比較，30 μM順鉑作用下，轉染miR-125a mimic組TW03細胞凋亡比例最小,與未轉染和過表達miR-125a-ASOs組比較，轉染miR-125a mimic組在順鉑的作用下抑制癌細胞生長比例最高(圖3a，圖3b)；順鉑作用后，隨著時間的推移，過表達miR-125a后普通的鼻咽癌細胞株TW03組與順鉑抵抗的鼻咽癌細胞株TW03組比較，細胞增殖能力增強(圖4)。

圖3 過表達miR-125a抑制鼻咽癌細胞株TW03凋亡情況

圖4 過表達miR-125a對鼻咽癌細胞株TW03增殖的抑制情況 *與TW03/DDP比較，P < 0.05

3 討論

已有文獻證實，microRNAs廣泛參與了鼻咽癌的發生、發展及預后。Wang等[6]研究了miR-429負性調控鼻咽癌的機制，認為其可以成為鼻咽癌治療和預后的監測指標；Xu等[7]報道，miR-124-3p可通過下調STAT3的轉錄，從而促進鼻咽癌細胞凋亡和抑制其增殖；Ou等[8]報道miR-21可被STAT3激活，從而通過PTEN-AKT信號通路誘導鼻咽癌細胞增殖，抑制其凋亡；Deng等[9]發現miR-214通過AKT信號通路負性調控乳運鐵蛋白的表達，從而負性調控鼻咽癌細胞的生長；Liu等[10]證實細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 4(CDK4)和miR-15a是鼻咽癌發病機制的反饋刺激因子，并可誘導化療藥物耐受。有關microRNAs與順鉑化療抵抗的關系，已有部分文獻報道:Shen等[11]研究MicroRNA-137可降低順鉑藥物在肺癌化療的敏感性；Zhou等[12]報道下調microRNA-375可以通過調節ERBB2增加順鉑對胃癌細胞的化療敏感性。有關miR-125a在癌癥中的研究，已有文獻報道:Dai等[13]顯示miR-125a可通過血管內皮生長因子A調節胃癌血管形成。Lehmann等[14]認為miR-125a等可以作為乳腺癌分級、受體狀態和分子類型的潛在分子標志物。盡管文獻基礎有關順鉑耐藥的microRNAs和miR-125a在其他癌癥中的應用已有報道，但目前有關miR-125a在順鉑對鼻咽癌耐藥中的研究還未見報道，探索miR-125a在順鉑抵抗的鼻咽癌治療過程中的作用，對鼻咽癌的化療非常重要。

本研究證實順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細胞株對順鉑治療反應性降低并高表達has-miR-125a，miR-125a是順鉑耐藥誘導的關鍵基因，順鉑抵抗時，其表達顯著增高，可抑制癌細胞的凋亡，對癌細胞的增殖抑制作用也顯著降低。為了進一步闡述miR-125a在順鉑抵抗中的作用，本實驗過表達了miR-125a(miR-125a mimic)和anti-miR-125a (miR-125a-ASOs)，研究干預miR-125a基因對順鉑耐藥的影響，結果發現:去除miR-125a基因的影響，順鉑耐藥情況得到有效改善，鼻咽癌細胞的凋亡率增加，增殖率降低；反之，加強miR-125a基因的影響，可促使順鉑耐藥的發生，鼻咽癌細胞的凋亡率降低，增殖率增加。所以本研究證實miR-125a是順鉑耐藥的關鍵靶位點，這一發現可能為順鉑化療耐藥的解決找到新的分子靶點，也為下一步研究miR-125a調控順鉑抵抗的分子機制打下了堅實的基礎。

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The relationship between MiR-125a induction expression and apoptosis of cisplatin resistant nasopharyngeal carcinoma cell line

HUQiong-ying1，AICheng-jin1，ZHANGShuang1，XIONGDa-qian1，JIANGZe-you1，ZHAOZi-yi2，ZHANGChao-ming1
(a.DepartmentofLaboratoryMedicine，b.CentralLaboratory，TeachingHospitalofChengduUniversityofTCM，Chengdu610072，China)

ZHANGChao-ming

Objective To search the novel molecule targets or biomarkers for cisplatin resistant patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC)，we detected the expression levels of miR125a in cisplatin resistant TW03 cells (TW03/DDP).Methods After construction of a cisplatin resistant TW03 cell model (TW03/DDP)，the expression levels of miR125a were examined by RT-qPCR.After over expression of miR-125a and application of anti-miR-125a，the apoptosis and proliferation of TW03 cells were examined.Results In the TW03/DDP cells，the expression levels of miR125a were up-regulated.The cisplatininduced expression of miR125a inhibited apoptosis of the TW03 cells.Conclusion The present study revealed that induction of the expression of miR125a by treatment with cisplatin results in resistance to the cisplatin drug in the NPC cells.

Nasopharyngeal carcinoma； Cisplatin resistance； miR-125a； Apoptosis

成都中醫藥大學科技發展基金資助項目(編號:030029045)

張朝明

R739.62

A

1672-6170(2016)05-0043-04

2016-05-10；

2016-06-24)