木瓜蛋白酶酶解豆渣制備鋅螯合鹽

吳瑞藍，林嘉怡，周燕芳，衷明華

（韓山師范學院，廣東潮州　521041）

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木瓜蛋白酶酶解豆渣制備鋅螯合鹽

吳瑞藍，林嘉怡，*周燕芳，*衷明華

（韓山師范學院，廣東潮州521041）

摘要：針對豆渣蛋白含量高、產量大而未被充分開發利用的特點，研究采用木瓜蛋白酶酶解豆渣以制備鋅螯合鹽，從而實現提高大豆加工副產物豆渣資源的附加值。以豆渣為原料，通過單因素試驗和正交試驗，優化木瓜蛋白酶的酶解工藝條件，并研究豆渣酶解物與鋅螯合制備多肽螯合鹽的工藝。結果表明，木瓜蛋白酶最佳酶解條件為酶解溫度50℃，酶解時間6 h，酶添加量0.04 g，豆渣添加量5 g，并以硫酸鋅為鋅源，得到的螯合率和螯合物中的鋅含量分別為53.78%和40.00%。

關鍵詞：豆渣；木瓜蛋白酶；鋅螯合鹽

衷明華（1957—），男，碩士，教授，研究方向為分析化學。

0　引言

大豆在我國乃至世界都是最重要的植物之一，從大豆及其衍生產品中開發新一代補鋅產品，原料來源容易、成本低、消費者易接受，可滿足大規模生產［1-2］。豆渣是生產豆奶或豆腐過程中的副產品，每年我國豆渣的產量都很大，因其具有較高蛋白質含量的特點，被當作飼料，用于制作糕點食品、健康食品以及化妝品和抗菌素原料。豆渣酶解液含有豐富的氨基酸、小肽、微量元素等多種小分子營養成分，具有生物利用率高等優點［3-4］。其中，鋅是人體必需微量元素，參與體內200多種金富酶的組成，是細胞內最豐富的微量元素。因此，加強對豆渣的利用研究有著重要的意義。

越來越多的研究表明，多肽鋅螯合鹽的吸收轉運機制能夠按照多肽的轉運機制進行，而非人體腸道中無機鋅鹽的吸收體制，因此氨基酸或肽的鋅螯合鹽具有更好的吸收率，生物利用率也較高。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆渣，市售；木瓜蛋白酶（10×104U/g，固體粉末）、考馬斯亮藍、牛血清蛋白、無水硫酸鋅（ZnSO4）、95%乙醇、EDTA、檸檬酸鈉緩沖劑（pH值5）、NH3-NH4Cl緩沖液（pH值10）、絡黑T、三乙醇胺、無水乙醇、無水硫酸鎂（MgSO4），均為分析純。

1.2儀器與設備

2K072型電熱真空干燥箱，上海市實驗儀器總廠產品；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器公司產品；SDH-III型循環水式多用真空泵，上海丞明儀器設備有限公司產品；KA-1000型離心機，上海安亭科學儀器廠產品；722SP型分光光度計，上海棱光技術有限公司產品。

1.3試驗方法

1.3.1豆渣粗蛋白含量的測定

采用凱氏定氮法［5］。

1.3.2酶解液中多肽含量的測定

采用考馬斯亮藍法［6］。

1.3.3檢測方法

（1）鋅含量的測定采用EDTA絡合滴定法［3］。按式（1）計算螯合物中鋅含量：

（2）螯合率的測定。移取10 mL待測液，加入95%乙醇沉淀（乙醇含量達到90%以上），靜置，過濾；將濾液再次濃縮后進行乙醇沉淀（乙醇含量達到95%以上），靜置，過濾。取濾液測定游離鋅含量，按式（2）計算螯合率。

1.3.4豆渣酶解液的制備工藝流程

豆渣→加入適量木瓜蛋白酶→酶解→抽濾→離心→取上清液→測定多肽轉化率。

1.3.5單因素試驗

木瓜蛋白酶酶解豆渣時，影響酶解反應的主要因素有酶解溫度、酶解時間、酶添加量、豆渣添加量等。因此，試驗以酶解溫度、酶解時間、酶添加量、豆渣添加量為考察因素。

（1）最佳酶解溫度的確定。設定酶添加量0.03 g，酶解時間3 h，豆渣添加量2 g，選擇酶解溫度30，40，50，60，70℃，以多肽轉化率為指標確定最佳酶解溫度。

（2）最佳酶解時間的確定。設定酶添加量0.03 g，豆渣添加量2 g，酶解溫度60℃，選擇酶解時間為2，3，4，5，6 h，以多肽轉化率為指標確定最佳酶解時間。

（3）最佳酶添加量的確定。設定酶解時間為3 h，豆渣添加量為2 g，酶解溫度為60℃，選擇酶添加量為0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 g，以多肽轉化率為指標確定最佳酶添加量。

（4）最佳豆渣添加量的確定。設定酶添加量為0.03 g，酶解時間為3 h，酶解溫度為60℃，選擇豆渣添加量為1，2，3，4，5 g，以多肽轉化率為指標確定最佳豆渣添加量。

1.3.6五因素四水平正交試驗設計優化酶解工藝條件

在單因素試驗的基礎上，以多肽轉化率為指標，采用五因素四水平正交試驗設計，試驗采用L16（45）正交表。

試驗的因素與水平設計見表1。

1.3.7豆渣多肽鋅螯合鹽的合成工藝

表1　試驗的因素與水平設計

酶解液→調整合適的螯合條件（pH值5.0、螯合溫度60℃、螯合時間40 min）→加入適量硫酸鋅（肽鋅質量比2.25∶1）→乙醇沉淀（乙醇含量達到90%以上，靜置）→過濾→干燥。

2結果與分析

2.1單因素試驗

豆渣的粗蛋白含量為38.76%，按式（3）計算多肽轉化率：

2.1.1酶添加量對豆渣酶解液中多肽含量的影響酶添加量對豆渣多肽轉化率的影響見圖1。

圖1　酶添加量對豆渣多肽轉化率的影響

在豆渣添加量為2 g的條件下，加入不同量的木瓜蛋白酶，在60℃恒溫酶解3 h，測定多肽轉化率。由圖1可知，酶添加量為0.03 g的多肽含量最高。

2.1.2豆渣添加量對豆渣酶解液中多肽含量的影響

豆渣添加量對豆渣的多肽轉化率的影響見圖2。

圖2　豆渣添加量對豆渣多肽轉化率的影響

在酶添加量為0.03 g的條件下，加入不同量的豆渣，在60℃恒溫酶解3 h，測定多肽轉化率。由圖2可知，豆渣添加量為5 g的多肽含量最高。

2.1.3酶解溫度對豆渣酶解液中多肽含量的影響

酶解溫度對豆渣多肽轉化率的影響見圖3。

圖3　酶解溫度對豆渣多肽轉化率的影響

木瓜蛋白酶的有效溫度范圍是20～80℃，由圖3可知，作用于豆渣蛋白的最佳酶解溫度是60℃。

2.1.4酶解時間對豆渣酶解液中多肽含量的影響

酶解時間對豆渣多肽轉化率的影響見圖4。

圖4　酶解時間對豆渣多肽轉化率的影響

在酶添加量為0.03 g，豆渣為2 g的條件下，在60℃恒溫酶解，測定不同酶解時間的多肽轉化率。由圖4可知，酶解時間為3 h的多肽含量最高。

2.2五因素四水平正交試驗的結果與分析

采用五因素四水平正交試驗設計對豆渣蛋白的酶解工藝條件進行優化，將試驗數據按L16（45）正交表填入。控制酶解的效果以多肽轉化率為分析指標。

2.2.1結果分析

試驗結果與分析見表2。

由表2可知，以試驗為15的多肽轉化率最高，其水平組合為A4，B3，C2，D4，分別是各因素影響最大的水平。本試驗各因素的最優組合為A2，B4，C2，D4，對2個組合轉化率比較后得出最優組合高于最大水平組合。而通過極差R值的大小可以看出本試驗因素存在顯著性順序，其主次關系為C＞A＞D＞B，即影響豆渣酶解反應的最主要因素是酶解溫度，其次是酶添加量、酶解時間、豆渣添加量。

2.2.2結果與討論

通過利用正交試驗設計得出用木瓜蛋白酶酶解豆渣時，對試驗影響最大的因素是酶解溫度。豆渣蛋白的最佳酶解條件為酶解溫度50℃，酶添加量0.04 g，酶解時間6 h，豆渣添加量5 g。

2.3螯合率及螯合物中鋅含量的測定結果

在肽鋅質量比為2.25∶1，pH值5.0的條件下，移取20 mL的酶解液，在60℃恒溫螯合40 min，得到的螯合率和螯合物中的鋅含量分別為53.78%和40.00%。

表2　試驗結果與分析

3　結論

本試驗選用豆渣進行酶解得到多肽液，并與鋅進行螯合，得到新一代的補鋅產品多肽鋅螯合鹽。通過單因素試驗和五因素四水平正交優化試驗，得到木瓜蛋白酶酶解豆渣的最佳酶解條件為酶解溫度50℃，酶添加量0.04 g，酶解時間6 h，豆渣添加量5 g。在螯合溫度為60℃，pH值為5.0，螯合時間為40 min，肽鋅比為2.25∶1的條件下，測得的螯合率為53.78%，螯合物中鋅含量為40.00%。

參考文獻：

［1］楊珊珊.羅非魚皮多肽鋅螯合鹽的制備及性質研究［D］.南昌：南昌大學，2008.

［2］趙洪雷.鰱魚蛋白小肽鋅螯合鹽的制備及其生物活性研究［D］.武漢：華中農業大學，2009.

［3］牛翠英，沈敏，肖珊.鈣鋅鹽中鋅含量的測定-EDTA絡合滴定法［J］.中國井礦鹽，2010，41（3）：30-32.

［4］彭燕，關志強，張鐘，等.羅非魚下腳料蛋白深度水解的工藝優化［J］.廣東農業科學，2011（6）：116-119.

［5］陸衛明，尹華.用蛋白質測定儀測定食品中的蛋白質［J］.江蘇預防醫學，2007，18（1）：61-62.

［6］鄧麗莉，潘曉倩，生吉萍，等.考馬斯亮藍法測定蘋果組織微量可溶性蛋白含量的條件優化［J］.食品科學，2012（24）：185-189.

Enzymatic Hydrolysis of Soybean Dregs by Papain to Prepare Zinc Chelate Salt

WU Ruilan，LIN Jiayi，*ZHOU Yanfang，*ZHONG Minghua
（Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong 521041，China）

Abstract：Bean dregs protein content is high，large output without being fully exploited the characteristics of study papain bean dregs to prepare a zinc chelate salt，in order to achieve increase the added value of soybean byproducts bean dregs resources.The bean dregs as the raw material，through a single factor test and orthogonal test conditions papain enzyme and research bean dregs hydrolysates and polypeptides chelated zinc chelate salt preparation of process.The results show that papain optimum conditions for hydrolysis temperature 50℃，time 6 h，enzyme dosage 0.04 g，bean dregs quality 5 g，zinc sulfate and zinc source，chelating rate and chelate zinc content are obtained 53.78%and 40.00%.

Key words：bean dregs；papain；zinc chelate salt

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.05.033

文章編號：1671-9646（2016）05b-0016-03

收稿日期：2016-03-31

作者簡介：吳瑞藍（1994—），女，本科，研究方向為農產品加工與開發。

*通訊作者：周燕芳（1979—），女，本科，高級實驗師，研究方向為農產品加工與開發；