響應面微波輔助提取金花茶花多糖工藝研究

劉茜+許子競+胡旭飛

摘 要 為優化金花茶花中水溶性多糖微波提取工藝，在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法建立了金花茶花多糖（CCFP）微波提取的二次響應曲面方程.試驗的三因素（溫度、時間和液料比）對CCFP提取有不同的影響.結果表明，在試驗范圍內，通過方差分析得出，微波提取溫度對CCFP影響最大，其次為提取時間，液料比對CCFP提取率影響最小.試驗因素的最佳條件為：提取溫度77 ℃，時間10 min，液料比為26 mL∶1 g.在此條件下，CCFP提取率可達3.40%，與模型預測值3.56%很接近.

關鍵詞 金花茶花；微波輔助浸提；多糖；響應面分析

中圖分類號 O629 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2016）03-0040-06

Abstract In order to optimize the conditions of microwave-assisted extraction method of polysaccharides from Camellia Chrysantha （Hu） Tuyama flowers（ CCFP）， an equation for the microwave extraction was obtained on the basis of single-factor experiments. Our results show that the extraction temperature， extraction time and solvent to material ratio have different effects on the yield of CCFP. Our study indicates that the order of importance of these factors affecting on the extraction yield is as follows： microwave treatment temperature， microwave treatment time and solvent to material ratio. The optimal condition of the microwave extraction of CCFP is at 77 ℃ for 10 min with 1∶26（g/mL） as the solvent to material ratio. The extraction rate of CCFP can be up to 3.40%， agreeing well with the predicted value of 3.56%.

Key words Camellia chrysantha （Hu） Tuyama flowers； microwave-assisted extraction technology； polysaccharides； response surface analysis

山茶科山茶屬的金花茶（Camellia chrysantha （Hu） Tuyama）為常綠灌木至小喬木，是我國珍稀瀕危植物，其葉為深綠色，皮灰黃色，花蠟質金黃，金瓣玉蕊，耀眼奪目，晶瑩而油潤，呈杯狀、壺狀或碗狀，有“植物界大熊貓”、“茶族皇后”之美稱，國外則稱之為“幻想中的黃色山茶花”，僅分布于我國廣西的西南部[1-2].金花茶的藥用在《本草綱目》中有記載，在廣西壯族民間是一種傳統中草藥， 臨床實驗研究表明，金花茶花水提物可降血壓、降血脂、降低膽固醇，可在某種程度上抑制轉移性惡性腫瘤的生長，防止動脈粥樣硬化等[3-4].藥理研究也指出，表現金花茶生理活性的重要組成部分是其所含的多糖[5-7]，對于金花茶花多糖（Camellia chrysantha（Hu） Tuyama flowers polysaccharide（CCFP））的提取工藝研究，目前國內外未見報道.

微波輔助提取具有快速、簡單、安全、低耗等優點，被廣泛用于植物有效成分的提取.本實驗采用微波輔助提取CCFP[8-9]. 在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析法建立回歸方程，計算出影響因子與影響因子、影響因子與指標（花多糖提取率）之間的相互關系，根據得出的結果優化CCFP提取工藝條件.

1 材料與方法

1.1 實驗試劑、材料及儀器

金花茶花由廣西合浦佳永金花茶開發有限公司提供；丙酮、無水乙醇、甲醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚等均為分析純.

微波提取器（廣州興興微波能技術有限公司），2102PCS紫外-可見分光光度計（尤尼科（上海）儀器有限公司），FD-1-80冷凍真空干燥器（北京博醫康實驗儀器有限公司），RE-52 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化有限公司）， DLSD-500低溫冷卻循環泵（鄭州長城科工貿有限公司），AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），KA-1000臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）.

1.2 試驗方法

1.2.1 CCFP的提取工藝流程 金花茶花→陰干→粉碎→無水乙醇、丙酮脫除蠟脂→烘干→粉碎過0.282 mm（50目）篩→稱重→微波提取3次→合并濾液→減壓濃縮到體積1/5 →離心→取上清液→Sevag法脫蛋白→減壓濃縮后加乙醇至含醇80%→于4 ℃冰箱過夜靜置→離心→沉淀物用無水乙醇、丙酮洗滌→冷凍干燥→CCFP.

1.2.2 CCFP含量及提取率測定 采用苯酚-硫酸法測多糖：以葡萄糖為標準品（采用0.9的系數校正），測定總糖含量，再采用DNS法測定還原糖含量[10].CCFP含量=總糖含量-還原糖含量；CCFP提取率=[多糖干品質量（g）/原料質量（g）] × 100%.

1.2.3 單因素試驗 CCFP的提取率主要受微波提取時間、溫度和液料比3個因素影響.試驗在固定微波功率（600 W）下進行，考察不同的液料比、提取溫度、提取時間對CCFP提取率的影響.

1.2.4 CCFP最優提取工藝的設計與試驗 以1.2.3單因素實驗結果為基礎，根據Benhnken中心組合試驗設計原理，確定響應面分析法所建立的二次響應曲面方程的3個自變量[11]：提取時間（Z1）、提取溫度（Z2）、液料比（Z3），以提取率（Y）為響應值，試驗因素與水平設計見表1.通過響應曲面分析（response surface analysis， RSA）得出最佳的提取條件[12-14]，根據優化條件進行3次平行實驗，取3次實驗所得提取率的平均值，并與理論預測值比較.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 微波提取時間對CCFP提取率的影響 把預處理原料固定液料比25 mL∶1 g，提取溫度75 ℃，改變提取時間進行實驗研究，考察微波提取時間對CCFP得率的影響.從圖1可知，CCFP提取率隨提取時間的延長發生變化，當微波提取時間增至10 min時，提取率達到最大值，隨著提取時間延長，提取率無明顯提高，綜合考慮CCFP的提取率和功效關系，確定試驗的最佳提取時間為10 min.

2.1.2 提取溫度對CCFP提取率的影響 把預處理的原料固定液料比為25 mL∶1 g，提取時間為10 min，改變提取溫度進行實驗研究，考察溫度與CCFP提取率的關系.如圖2所示，在75 ℃之前， CCFP的提取率幾乎與溫度成線性關系，在溫度上升到80 ℃以后，CCFP提取得率略有減少，可能是溫度低于80 ℃時，微波對多糖的結構與活性破壞較小，而較高溫度時微波對多糖結構有影響.故確定試驗的提取溫度為75 ℃.

2.1.3 液料比對CCFP提取率的影響 把預處理原料固定提取溫度75 ℃，時間10 min，以不同的液料比進行實驗研究，研究液料比對CCFP提取率的影響.如圖3所示，隨著液料比的增加，CCFP提取率提高明顯，這是因為增加提取溶劑，對CCFP有稀釋的效果，但當液料比達到25 mL∶1 g后，這種效果不明顯，而隨著液料比增加反而會影響后續的工作，故確定試驗的液料比為25 mL∶1 g.

2.2 響應曲面法優化CCFP的提取工藝條件

2.2.1 響應曲面分析方案與結果研究 在單因素試驗的基礎上，通過Design-expert 8.2軟件程序，采用提取溫度、時間和液料比三因素和三水平SAS的分析方法，通過二次響應曲面分析，對CCFP提取的微波條件進行優化.

對時間（Z1）、溫度（Z2）和 液料比（Z3）作如下變換：設X1=（Z1-10）/2， X2=（ Z2-75）/10， X3=（ Z3-25）/5，以因素X1，X2，X3作自變量，CCFP的提取率為響應值（Y），試驗方案及相應結果如表2所示.

對該模型進行方差分析，結果見表3.根據上述回歸方程作出響應曲面和等高線圖，如圖4～6所示.等高線的形狀反映出兩交互因素效應的大小，橢圓形表示兩交互因素作用強，而圓形則相反.

從表3可知，方程的F=30.776 3>F0.01（9.3），模型P<0.01， 表明該二次回歸方程極顯著，而失擬項不顯著（P=0.279 0>0.05）.模型R2=0.950 4（校正系數），說明方程的擬合狀況良好，可用該模型解釋9504%的響應值的變化.復相關系數為98.23，說明該模型擬合度較好.一次項X2，二次項X21和X22的P<0.01說明其對CCFP得率的響應曲面影響極為顯著，一次項X1為顯著因素（P<0.05）， 而交叉項X1X2，X1X3，X2X3影響不顯著（P>0.05），表明3個影響因素之間的交互效應影響小.通過對F值的檢驗可知，試驗3個因素對CCFP提取率影響的順序為：X2>X1>X3.從典型分析表（表4）可知，3個因素的特征值全為正，表明該模型穩定點為提取最佳值.

從表4可知，三條件的X值為：X1=0.141 8，X2=0.178 3，X3=0.161 4，根據公式（X優-X中）/X間=X值求得，該方法的優化工藝條件為：Z1=10.283 6 min，Z2=76.783 ℃，Z3=25.807∶1， 即微波輔助提取金花茶花多糖的最優工藝條件為：提取時間10 min，提取溫度 77 ℃，液料比26 mL∶1 g.用此工藝參數進行3次平行實驗，實際提取率的平均值為3.40%，而在此條件下，提取率的理論值為3.56%，實際得率與理論預測得率僅差0.16%，說明回歸模型具有較高的可靠性.

3 結論

以金花茶花粉末為原料，水為溶媒，借助微波輔助提取CCFP，效率快，溫度低，提取率高，適宜于金花茶花中的多糖及熱敏性成分提取.利用響應面對CCFP的提取工藝進行優化，得最佳條件為：溫度77 ℃，時間10 min和液料比26 mL∶1 g.在此條件下，CCFP提取率理論值為3.56%，實際提取率可達3.40%.

參考文獻：

[1] 韋 霄，蔣運生，韋記青，等.珍稀瀕危植物金花茶地理分布與生境調查研究[J].生態環境， 2007，16（1）：895-899.

[2] YANG Q H， XIAO W， ZENG X L， et al. Seed biology and germination ecophysiology of camellia nitidissima[J]. For Ecol Manage， 2008，225（1）：113-118.

[3] 陳永欣，呂淑娟，韋錦斌.金花茶化學成分和藥理作用研究進展[J].廣西中醫藥， 2013，36（1）：4-5.

[4] 趙元華，劉會芳，何榮霞.金花茶抗腫瘤作用的研究進展[J].醫學綜述， 2015，21（16）：2995-2997.

[5] 田曉春，秦小明，林華娟，等.金花茶多糖理化性質的研究[J].中國食品學報， 2011，11（8）：47-52.

[6] 沈 潔，張可鋒，朱 華.金花茶的化學成分及其藥理作用的研究進展[J].內蒙古中醫藥， 2011，30（2）：121-122.

[7] 韋 霄，黃興賢，蔣運生.3種金花茶組植物提取物的抗氧化活性比較[J].中國中藥雜志， 2011，36（5）：639-640.

[8] 衛 強，江敦清，紀小影，等.微波輔助提取垂絲海棠花中多糖及其抗氧化研究[J].食品工業技術， 2014，36（3）：137-141.

[9] HAN S C， WING N L，YI X X. An Acidic polysaccharide from tribulus terrestris[J]. Chin Chem Lett， 2002，13（7）：625-628.

[10] 張維杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州：浙江大學出版社， 1994：13-16.

[11] BOX G E， HUNTER W G. Statistics for experiments： an introduction to design data analysis and model building[M]. New York：Wiley，1990.

[12] 張喬會，逄錦慧，楊 喆，等. 響應面法優化杜香多糖提取工藝[J].天然產物研究與開發， 2015，27（6）：1105-1108.

[13] 馬艷弘，劉 晨，張宏志，等.響應面法優化蘆薈皮多糖的微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究[J].江西農業大學學報（自然科學版）， 2015，37（1）：149-156.

[14] 許子競，黎貴卿，黃 麗，等.金花茶葉多糖微波輔助提取工藝優化和含量測定[J].食品科學， 2010，31（4）：53-58.

（編輯 WJ）